不同體外培養方法對去透明帶小鼠胚胎發育的影響

王雅光　高源　秦書儉

[摘要] 目的 探討不同體外培養方法對小鼠去透明帶胚胎發育的影響。 方法 以胚胎各階段發育率、囊胚率和囊胚細胞數作為衡量指標，對比微滴單卵法、微滴群卵法、微滴單卵+群卵法、mWOW培養法（the modified “well of well” system）四種體外培養方法，探討不同體外培養方法對去透明帶胚胎發育的影響。 結果 mWOW培養法、微滴單卵+群卵法、微滴單卵法這三種方法之間的發育率、囊胚率以及囊胚數均有顯著差異（P<0.05）。 結論mWOW法與其他三種方法相比，更適合作為體外培養去透明帶小鼠8-細胞以后階段的方法，以及用于體內移植小鼠胚胎的體外培養方法。

[關鍵詞] 胚胎培養技術； 胚胎發育； mWOW法

[中圖分類號] Q954.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）16-0018-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of different culture methods in vitro mouse zona-free embryonic development. Methods In various stages of embryonic development rate，blastocyst rate and cell numbers of blastocysts developed were measured as mWOW system （the modified “well of well” system）， micro-drops single + group， micro-drops single and micro-drops group culture in vitro. The effects of different methods of were compared in vitro embryo development zona-free. Results Embryonic development rate， blastocyst rate and cell numbers of blastocysts developed were significantly higher in mWOW system culture than micro-drops single + group， micro-drops single and micro-drops group culture. Conclusion Compared with micro-drops single + group，micro-drops single and micro-drops group culture，mWOW system method is more suitable for zona-free cultured in vitro mouse embryos.

[Key words] Embryo culture techniques； Embryonic development；mWOW method

現階段，體外培養去透明帶小鼠胚胎已經成為研究早期胚胎發育機制、制備轉基因小鼠等科學研究領域中的重要環節。但是由于去透明帶后的胚胎容易因為黏附聚集的問題發育延遲或者停止，影響囊胚率和囊胚質量。因此，有學者[1]提出如要推動慢病毒感染去透明帶胚胎技術的發展，需要考慮的是如何完善去透明帶胚胎體外培養系統。

目前，去透明帶胚胎體外培養方法主要有微滴單卵法、微滴群卵法、微滴單卵+群卵法、mWOW培養法。本實驗將通過這四種方法對比來培養去透明帶胚胎并觀察其發育情況，通過對每個階段囊胚細胞個數、囊胚率以及發育率的檢測，來討論四種體外培養方法對去透明帶胚胎發育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

本實驗于2011年3月～2012年3月完成。由遼寧醫學院實驗動物中心提供的4～6周齡的SPF級昆明小鼠，PMSG購自鄭州華畜動物制藥廠，FHM操作液、KSOM培養液購自Jibco公司，人絨毛促性腺激素、石蠟油、透明質酸酶、鏈酶蛋白酶、PVP均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 超數排卵 取已適應本鼠舍光照周期（內源LH釋放時間受光照周期的調控）的昆明小鼠，進行超數排卵的時間為下午1時，注射PMSG，過48 h后注射hCG（注射方法均經腹腔，劑量均為10 IU/只），然后將雌雄（2∶1）合籠，次日上午通過檢查陰道栓方式確定受精母鼠。

1.2.2 去除卵丘細胞及透明帶 經陰道栓檢查確定受精的母鼠頸椎脫臼處死，在無菌條件下快速取出輸卵管及靠近輸卵管部分的子宮，放置在FHM操作液里。鏡下取出合子團，然后將其放入含有透明質酸酶（濃度為0.3 mg/mL）的FHM操作液里，將卵丘細胞吹打脫落以后，再將重新收集的合子放入準備好的FHM操作液里，繼續洗去雜質、透明質酸酶以及殘留的卵丘細胞等。最后在鏈酶蛋白酶液（濃度為0.5%）中放入洗滌好的合子，同時鏡下觀察透明帶，待其溶解后，再迅速放入新鮮的FHM操作液中清洗，之后再經KSOM培養液洗滌。

1.2.3 實驗分組及培養 將收集的去透明帶合子，根據實驗設計分為四組，A：微滴單卵培養組；B：微滴群卵培養組；C：微滴單卵+群卵培養組；D：mWOW培養組。

微滴單卵培養組：將用KSOM-AA培養液做的20個2 μL的微滴滴在35 mm的培養皿（塑料無菌）上，待2 h后將每個微滴里放入1枚合子，放于37℃、5%CO2培養箱中培養。

微滴群卵培養組：將用KSOM-AA培養液做的1個3 μL的微滴滴在35 mm的培養皿（塑料無菌）上，所有微滴用石蠟油覆蓋，待2 h后每個微滴里放入20～25枚合子，放于37℃、5%CO2培養箱中培養。

微滴單卵+群卵培養組：觀察待微滴單卵培養方法體外培養出來的胚胎基本已經完全發育到8-細胞階段，此時開始進行群體的培養，移動時使用移卵管，以減少胚胎的損傷。

mWOW培養組：按照Pereira等[2]制作mWOW孔的方法，將針頭加熱后在35 mm無菌塑料培養皿上20個孔（孔深0.2 mm、直徑0.3 mm左右），之后打完孔的培養皿用KSOM和DDW培養液洗滌使孔中的雜質清除。所有的mWOW孔先用400 μL KSOM培養液滴覆蓋，然后KSOM培養液滴上再覆蓋一層薄薄的石蠟油。待2 h后將每個mWOW孔里放置一枚合子，放于37℃、5%CO2培養箱中培養。

本實驗重復培養6次，隨機將484枚合子（去透明帶）分成四組；即微滴單卵組合子數為120枚、微滴群卵組合子數為124枚、微滴單卵+群卵組合子數為120枚、mWOW組合子數為120枚，四個組用相同的培養皿和培養液培養。2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚以及囊胚發育情況的檢測時間，分別是在培養到20 h、40 h、52 h、64 h、88 h。取出的囊胚經過染色計算囊胚細胞數。見表1。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，采用析因方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同體外培養方法培養去透明帶合子后的發育情況

由于去透明帶后的合子黏性增加粘連而使微滴群卵法只能在2-細胞階段統計發育情況，其他各階段都無法進行統計；其他三種方法均能進行發育率的計算。在2-細胞發育階段四種方法之間發育率差異無統計學意義（P>0.05）；在4-細胞發育階段微滴單卵法、微滴單卵+群卵法、mWOW法之間的發育率差異無統計學意義（P>0.05）；在8-細胞發育階段微滴單卵法與微滴單卵+群卵法發育率相比較沒有明顯的差異（P>0.05），而兩組均高于mWOW培養法的發育率，并且差異有統計學意義（P<0.05）；在桑葚胚發育階段mWOW法和微滴單卵+群卵法的發育率比較沒有明顯差異（P>0.05），但是兩組的培養率均高于微滴單卵培養法的發育率，并且差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2不同培養方法得到的囊胚回收率及囊胚計數情況

從囊胚回收率的結構上看微滴單卵法和微滴單卵+群卵法囊胚均是100%的回收率，與mWOW法的囊胚回收率相比有顯著統計學意義（P<0.05）；微滴單卵法、微滴單卵+群卵法和mWOW法三種方法得到的囊胚細胞數與體內囊胚的細胞數相比有顯著統計學意義（P<0.05）。群卵法和微滴單卵法與單純的微滴單卵培養方法相比較得到的囊胚的細胞數沒有明顯的差異（P>0.05），但是這兩種培養方法培養的囊胚細胞數與mWOW培養方法相比有顯著的統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

微滴培養法是傳統小鼠胚胎體外培養方法[3]，也是培養去透明帶胚胎的常用方法。經過多年發展，人們通過對微滴法進行改進，發明了微滴群卵法等諸多培養方式，以期進一步優化胚胎體外培養系統。但是，各種[4]改進方法雖然能夠發揮群體培養優勢，通過縮小胚胎間距來促進胚胎發育[5]，但是去透明帶胚胎相互黏連、聚合，導致無法繼續發育的問題無法解決。2000年Vajta等[6]發現WOW體外培養去透明帶的方法不但培養效率高，而且操作方法比較簡單。近年來，也有人相繼報道應用這一方法成功培養了單個胚胎，并且胚胎發育率及移植后妊娠率均顯著高于微滴法[7]，后來又有研究發現[8]單個胚胎的培養效果并不如群體的培養。2005年Daniela等[9]將WOW培養法進行了改進，因而有了mWOW培養方法，該方法是用一個400 μL的微滴覆蓋大約40左右個V形孔，改善了原來的一個微滴覆蓋一個V形孔的方法。這種方法不但解決了透明帶黏連問題還增強了胚胎之間的自分泌/旁分泌因子對胚胎發育的促進作用[10]，并且這種培養去透明帶胚胎的方法優于WOW法也得到了證實[11]。

四種方法結果進行對比分析：mWOW法除8-細胞階段發育率、囊胚回收率低于微滴單卵+群卵法和微滴單卵法，其他各階段mWOW法均顯著高于其他兩種方法，由于微滴群卵培養法因透明帶合子粘連無法進行統計將其除外。由于體外培養環境與體內培養環境不同，由于桑椹胚在體外經過短時間的發育就能形成胚囊，所以要求體外培養時間相對而言越短越好。所以選擇進行體外培養桑葚胚減少胚胎發育的損失進而會提高胚囊率。與8-細胞早期的胚胎比較致密化的桑椹胚的結構空間更穩定、胚胎更強韌，從而能盡可能地減少mWOW法對8-細胞期胚胎發育的不良影響。mWOW法的V形孔不但可以抑制有害因子的釋放，而且還能夠在一定程度上避免細胞因子的擴散[12]。綜上，mWOW法更適合作為體外培養去透明帶小鼠胚胎的方法。

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（收稿日期：2015-03-25）