鐵皮石斛莖段離體快繁研究進展

朱啟發+朱亞雄

摘 要：鐵皮石斛是具有藥用價值及經濟價值的名貴草藥。該文對近年來鐵皮石斛以芽繁芽離體快繁相關研究情況進行了整理與分析，從外植體的預處理與滅菌方法、基本培養基的選擇、植物生長調節劑等方面進行了綜述。

關鍵詞：鐵皮石斛；以芽繁芽；離體快繁

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）08-37-03

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為我國傳統草藥，是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）植物，以干燥莖入藥。是有藥用價值及經濟價值的名貴草藥，2010年版《中國藥典》將鐵皮石斛從石斛中單獨列出。因其原生地生境破壞和常年過度采挖，鐵皮石斛野生資源遭到嚴重破壞，瀕臨滅絕，已列入中國珍稀瀕危保護植物名錄[1]。利用植物組織培養技術建立其離體快繁體系是獲得大量種苗的有效途徑。研究表明，帶芽莖段具有分生能力強的特點，作為組織培養的外植體，不經過愈傷組織階段，直接萌發出芽，有利于保持該品種遺傳性狀穩定，是最理想的外植體[2]。為此，筆者將近年來鐵皮石斛以芽繁芽離體快繁相關研究情況進行了整理與分析，從外植體的預處理與滅菌方法、基本培養基的選擇、植物生長調節劑等方面進行了綜述，以期能為鐵皮石斛組織培養規模化生產提供理論基礎及技術參考。

1 外植體的預處理與滅菌方法

目前研究者們在采用鐵皮石斛帶芽莖段進行組培快繁時，使用的表面滅菌技術主要包括：選擇生長旺盛的鐵皮石斛幼嫩枝條，剝去節上葉片和膜質葉鞘，先用洗潔精或洗衣粉清洗后，用水龍頭下用自來水沖洗30～40min，濾干水分，將嫩枝剪成約1.5cm長帶莖節的小段，放入燒杯中在超凈工作臺中進行滅菌。滅菌采用常規方法，即75%酒精+0.1%升汞溶液的滅菌組合，75%酒精浸泡時間為35s，接著用0.1%升汞溶液浸泡，浸泡時間為10min，2次滅菌間隔用無菌水漂洗1次，滅菌結束后用無菌水漂洗4～5次，最后將經無菌濾紙吸干表面水分的外植體接種到適宜的腋芽誘導萌發培養基中[3-5]。經過上述滅菌方法處理后，外植體攜帶的微生物基本被清除，能夠達到較好的滅菌效果。

2 基本培養基的選擇

選擇何種基本培養基的是影響植物組織培養快速繁殖的重要因素。MS、B5、SH和White是常用的蘭科植物組織培養基，曹天旭等選擇這4種基本培養基研究不同基本培養基對鐵皮石斛生長的影響，試驗結果顯示，在MS和SH培養基中，鐵皮石斛的成苗數、鮮重和干重顯著高于White和B5培養基，兩者之間無顯著差異，但相比SH培養基，MS培養的鐵皮石斛試管苗顏色深綠，生長旺盛，芽數分化最多。綜合各項生長指標，MS基本培養基為營養成分比較全面的培養基，符合鐵皮石斛叢生芽的誘導和生長要求，為其最適培養基[6]。馬玉申等進行外植體腋芽誘導影響的對比試驗，從4種不同濃度的MS（MS、1/2MS、1/3MS和1/4MS）培養基中篩選鐵皮石斛組培快繁最適宜的基本培養基。結果顯示，鐵皮石斛芽在MS基本培養基中萌發率極低（7.5%），褐化嚴重而致外植體死亡；1/2MS培養基中，腋芽誘導率最高，達到65.0%，萌發的芽葉色翠綠、莖徑較粗，和其他3種培養基相比，芽的長勢最好；1/3MS和1/4MS培養基中的外植體，腋芽不萌發，絕大部分死亡[3]。目前在鐵皮石斛快繁技術的研究中一般采用MS或1/2MS培養基做為基本培養基[7-9]。

3 植物生長調節劑的影響

生長調節劑在植物組培快繁體系建立的過程中起著關鍵的作用。在植物組織培養中，生長素單獨使用時，主要起到促進細胞生長和伸長及根的分化的作用[10]，而單獨使用細胞分裂就能起到促進芽萌發的增殖的效果，但同時添加生長素和細胞分裂素，兩者的聯合作用對組培苗的生長更有利，更能促進側芽的萌發和生長[11]。在培養過程中，生長素和細胞分裂素的種類及濃度是影響組培苗快繁的關鍵因素之一。在鐵皮石斛以芽繁芽離體快速繁殖體系建立過程中，增值培養基可以和誘導培養基相同，一般采用6-BA和NAA組合居多，NAA濃度一般為0.2～1.0mg/L，6-BA濃度一般為0.5～3mg/L；生根階段一般采用IBA和NAA，IBA濃度為0.2～3.0mg/L，NAA濃度一般為0.2～0.5mg/L[12-15]。細胞分裂素KT也常被添加到培養基中用于鐵皮石斛組織培養離體快繁技術的研究，洪森榮等的研究試驗結果顯示，培養基中添加的KT濃度一定的情況下，在一定濃度范圍內，添加NAA濃度越高，鐵皮石斛帶芽莖段的增殖率越高，且芽增值率的高低與KT與NAA的濃度配比高低成正比[16]。多效唑是一種高效、低毒的植物生長延緩劑，且有廣譜殺菌作用[17]。在植物離體快繁體系建立中，主要用于壯苗和促進試管苗生長以及生根，蒙愛東等將多效唑用于鐵皮石斛試管苗培養，試驗效果好，適宜濃度的多效唑起到壯苗、促進試管苗生根以及提高移栽成活率的作用[18]。

4 影響鐵皮石斛以芽繁芽離體快繁的其他因素

4.1 添加物 在建立植物組培快繁體系研究中，常在不同階段培養基中添加附加物以達到提高產物產量的目的。選擇的添加物其有效成分多為氨基酸、酶、植物激素等物質，常用的添加物有馬鈴薯泥、香蕉泥、甘薯汁、冬瓜汁、木瓜乳、南瓜汁和椰乳等，多數研究證明它們能明顯促進組培苗的增殖和分化[19]。羅煥明等研究試驗結果得出馬鈴薯汁和木瓜乳有利于誘導鐵皮石斛組培苗芽的增殖，香蕉乳有利于誘導組培苗生根。試驗中還發現加入活性炭可以促進根系生長，利于試管苗的生長[20]。李霖明等研究分別在培養基中添加殼聚糖、綠豐源、海藻精和極可善對鐵皮石斛組培苗生長的影響，試驗結果表明，在相同的培養條件下，不同添加物對組培苗生長影響不同，極可善和殼聚糖有利于鐵皮石斛壯苗和促進試管苗生根；在增殖階段，添加極可善和海藻精可以提供鐵皮石斛組培苗增殖率[21]。

4.2 pH值 培養基的pH亦是影響鐵皮石斛離體組培快繁的關鍵因素，植物組織培養pH一般以5.0～6.0較適宜，pH高于6.0時，培養基硬度高，不利于外植體吸收養分；pH低于5.0時，培養基太軟，甚至不凝固，不利于外植體固定[22]。一般情況下鐵皮石斛組培的適宜pH范圍在5.6～5.8之間，pH過高或過低都會影響鐵皮石斛組培苗的生長。

4.3 瓊脂和碳源 在進行植物組織固體培養時，瓊脂是良好的固化劑。植物組織培養基中使用瓊脂的一般濃度為0.3%～1%，因為不同廠家生產的瓊脂質量不同會導致培養基凝固的適宜濃度不同，所以在使用前應進行不同瓊脂濃度的預實驗加以確定。鐵皮石斛組織培養中添加瓊脂濃度一般為0.4%～0.7%。植物本來能夠進行光合作用，合成碳水化合物，滿足自身生長的能量需求，不需要從外部供給糖。可是植物組織在離體后，依靠自養作用制造的碳水化合物難以滿足自身需求，必須從培養中吸收碳水化合物。蔗糖相對于其他碳源不僅價格低廉、購買方便，而且能滿足絕大多數植物離體培養所需的碳源[23]。目前，大部分植物組織培養試驗研究或者工廠化生產都選擇蔗糖作為碳源[24]。鐵皮石斛的離體組培快繁也采用糖作為碳源，其使用濃度范圍一般為2%～3%。

4.4 培養條件 組培苗的正常生長也像生長在自然界中的植物一樣依賴適宜的溫度和光照等培養條件。適宜組培苗生長的溫度一般在25～30℃，不同的品種的最適宜溫度差別很大[25]。光質、光照強度和光照時間長短都影響鐵皮石斛組培苗的生長。在鐵皮石斛組織培養中，培養室的培養條件一般設置為：溫度（25±1）℃，每天光照12h，光照強度1 000～2 000lx。

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（責編：徐煥斗）