白藜蘆醇誘導人肺腺癌A549細胞細胞凋亡及其與p38 MAPK信號途徑的聯系

華叢書，陳　海，張朝東，趙　歡，陳曉宇

◇藥學研究◇

白藜蘆醇誘導人肺腺癌A549細胞細胞凋亡及其與p38 MAPK信號途徑的聯系

華叢書1，陳海1，張朝東1，趙歡2，陳曉宇2

摘要目的探討白藜蘆醇（Res）誘導人肺癌A549細胞株凋亡及其與p38 MARK信號通路的聯系。方法CCK-8法檢測Res對人肺癌A549細胞增殖抑制作用，Annexin VFITC／PI雙染法檢測Res對肺癌A549細胞凋亡率，Western blot法檢測Res對人肺癌A549細胞Caspase剪切片斷（Caspase-1、Caspase-3）表達的影響，及其對絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路蛋白（p38、p-p38）表達的影響。結果Res對人肺癌A549細胞株生長呈濃度依賴性的抑制作用，48 h的Res作用肺癌A549的半數抑制濃度（IC50）值為（10．6± 1．2）μmol／L。用 10μmol／L Res處理A549細胞 24、36、48 h，細胞凋亡率較對照組明顯增加（P＜0．01）。Res作用于A549細胞 48 h后，Western blot法檢測顯示 Caspase-1、Caspase-3蛋白出現斷裂片斷，p38、p-p38表達亦增高。結論Res明顯誘導人肺癌A549細胞毒作用，誘導A549細胞凋亡，其機制與激活p-p38 MAPK途徑有關。

關鍵詞細胞凋亡；信號通路；白藜蘆醇；肺癌A549細胞

天然的多酚類化合物白藜蘆醇（resveratrol，Res）廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物體內。近年來，Res的藥理作用得到充分研究，Res具有廣泛的生物學和藥理學活性，如抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤和神經保護等效應［1］。研究［2］證實，絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，

2015－06－15接收

2安徽醫科大學組織胚胎學教研室，合肥230032

1　材料與方法

1．1材料

人肺癌細胞株A549購自上海中科院藥物研究所，傳代培養；Res（純度≥99．8%）購自美國Sigma公司，溶解于DMSO；RPMI 1640培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；CO2培養箱購自日本Sanyo公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標儀680型購自美國Bio-Rad公司；Annexin V－FITC／PI凋亡檢測試劑盒購自上海晶美生物公司；p38、磷酸化（p-p38）、ECL化學發光劑購自美國Cell Signal公司；兔多克隆抗體 Caspase剪切片斷（Caspase-1、Caspase-3）、β-actin及抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；細胞裂解液購自美國Upstate生物技術公司；其他試劑為國產分析純。

1．2方法

1．2．1細胞培養和傳代

人肺癌A549細胞用RPMI 1640培養液（含10%的胎牛血清）置于37℃、5%CO2培養箱培養，每3 d更換RPMI 1640培養1次。當A549細胞生長至80%融合時，0．25%胰蛋白酶消化、傳代細胞。

1．2．2CCK-8法測定細胞增殖

96孔板中，2 000個／孔的細胞密度接種A549細胞，分別加入Res（1、5、10、20、50μmol／L）組、空白對照組、溶劑對照組（等濃度DMSO），每組設4個平行孔。48 h后，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，讀取450 nm波長的吸光度（absorbance，A）值，即A450反映細胞增殖。細胞增殖率（%）＝各組A450／空白對照組A450× 100%。細胞增殖抑制率（%）＝（1－用藥組A450／空白對照組A450）×100%。按濃度梯度的對數將細胞增殖抑制率進行曲線擬合，計算Res的半數抑制濃度（halfmaximal inhabitory concentration，IC50）。

1．2．2Annexin V-FITC／PI雙染細胞法檢測

在檢測Res的IC50后，用10μmol／L Res處理A549細胞24、36、48 h，收集不同時間點Res處理A549細胞，胰酶消化，PBS洗滌2次，每次10 min，3 000 r／min離心5 min；1×結合緩沖液調整細胞密度為1×106／m l。取單細胞懸液0．5 ml，加入Annexin V-FITC 1．25μl，室溫18～24℃、避光、靜置15 min后離心；吸棄上層液體，加1×結合緩沖液0．5 m l重懸細胞，加入PI（10 mg／L）10μl染色，將標本置于冰塊中、避光。1 h內在流式細胞儀上測定細胞凋亡率。

1．2．3Western blot法檢測

取處于對數生長期的人肺癌A549細胞，RPMI1640稀釋至3×105個／ml，25 m l小培養瓶中接種培養，不同濃度Res（1、10、30μmol／L）的藥物作用48 h后，收集 A549細胞，PBS洗滌2次，每次10 min，加入100μl細胞裂解液，15 000 r／min離心10 min，BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白，將蛋白濃度調整一致。取裂解蛋白40 μg，加入3×SDS上樣緩沖液，95℃變性10 min。配制12%的SDS-PAGE分離膠，凝膠電泳后，電轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉，依次加入相應的一抗（兔多克隆抗體Caspase-1、Caspase-3、p38、pp38）4℃孵育過夜，以GAPDH作為內參。次日，pH ＝7．4的 TBST緩沖液（10 mmol／L Tris-Hcl，150 mmol／L NaCl，0．1%Tween 20）洗滌3次，每次10 min，加入相應二抗，37℃孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，在室溫下孵育2 h，洗滌3次，每次10 min，加入ECL檢測目的條帶的表達，放入暗盒中壓片，2 ～5 min后顯影、定影。

1．3統計學處理

2　結果

2.1Res對肺癌A549細胞體外增殖活性的抑制作用

Res（1、5、10、20和50μmol／L）對A549腫瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用（F＝8．641，P＝0．027），48 h，對A549細胞IC50時Res濃度值為（10．6±1．2）μmol／L，95%可信區間為56．2～63．6。與溶劑對照組比較，Res能明顯抑制A549細胞的增殖，且呈現明顯的濃度－效應關系。見圖1。

2．1．1流式細胞術檢測細胞凋亡率

本研究采用10μmol／L Res處理A549細胞，24、36、48 h，細胞凋亡率分別為（15．2±2．7）%、（22．8±3．6）%、（29．6 ±3．7）%，溶劑對照組細胞凋亡率僅為（2．3± 1．2）%，表明細胞凋亡率顯著增加（F＝13．476，P＝0．006）。見圖2。

2．1．2Res對肺癌A549細胞中Caspase-1、Caspase-3蛋白剪切的影響

完整的Caspase復合物（Caspase-1、Caspase-3）無活性，剪切后其被激活。用不同濃度 Res（1、10、30μmol／L）作用于肺癌A549細胞48 h后，Western blot法檢測顯示，隨著Res濃度的升高，Caspase-1、Caspase-3斷裂片段升高明顯。而未用Res處理的溶劑對照組無斷裂片段表達（圖3）。結果顯示，Caspase-1和Caspase-3已被快速活化，從而誘導肺癌 A549細胞凋亡。

2.2Res誘導肺癌A549細胞凋亡的p38 MAPK通路的的影響

Western blot法檢測10μmol／L Res處理肺癌A549細胞24、36、48 h，結果表明，24 h后p-p38 MAPK顯著增加，且隨著時間的延長，p-p38 MAPK增加更為明顯，總的p38 MAPK的變化不明顯（圖4）。可見，p-p38是其活性形式，這表明Res激活了p38信號轉導通路。

3　討論

Res含有多酚結構，具有較強的抗炎、抗氧化和抗自由基、調節機體免疫力作用［1］。研究［3］顯示，Res對腫瘤的發生、發展具有干擾和保護作用，Res能夠防止細胞癌變、抑制腫瘤細胞的擴散。本研究結果表明，與溶劑對照組比較，Res對肺癌A549細胞具有明顯的增殖抑制作用，隨著Res劑量的升高，其抑制作用增強，呈現明顯的濃度-效應關系。

本研究表明，Res對肺癌A549細胞具有很強的增殖抑制作用。為證實此作用是否與促進肺癌A549細胞凋亡有關，本研究應用 Res（10μmol／L）處理A549細胞，流式細胞術顯示，Res作用24、36、48 h，肺癌A549細胞凋亡率明顯高于溶劑對照組，具有一定的時間－效應依賴關系。故Res有抑制肺癌A549細胞增殖的作用，促進肺癌A549細胞凋亡。

研究［4］表明，Res通過影響凋亡相關基因表達影響誘導腫瘤細胞的凋亡，Res可通過Fas-FasL途徑誘導人直腸癌細胞株發生凋亡現象。Caspase-1 和Caspase-3在細胞凋亡過程中起著關鍵作用。Caspase-1位于細胞凋亡途徑的上游，其發生剪切后活化，活化的Caspase-1作為始動Caspase復合物，進一步誘導效應Caspase-3的活化，導致Caspase-3也發生斷裂，降解重要底物，使得蛋白酶級聯切割放大，使細胞最終走向凋亡［5］。本研究中，肺癌A549細胞中的Caspase-1和Caspase-3蛋白在加入Res處理后均發生斷裂，且呈濃度依賴關系。故Res能誘導A549細胞發生凋亡，其機制與Caspase復合物的活化和級聯放大效應相關。

為探討Res誘發肺癌A549細胞凋亡的可能機制，本研究檢測了p38 MAPK信號通路有關蛋白的表達。p38 MAPK含有絲氨酸／蘇氨酸殘基的蛋白激酶，廣泛分布于細胞質與細胞核中，p38 MAPK激活后可調節細胞增殖、凋亡等活動［6－7］。p38定位于靜止細胞的胞質中，激活后，p38移位至細胞核，激活一系列轉錄因子，引起級聯反應。如p38磷酸化激活轉錄因子，參與轉錄因子復合物AP-1的構成，進一步調節腫瘤壞死因子-α、p53、原癌基因等基因的表達，引起細胞凋亡［8］。本研究顯示Res明顯激活p38途徑，調控肺癌A549細胞凋亡，但其機制仍需進一步研究。

參考文獻

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中圖分類號R 737．3

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1447－04

基金項目：國家自然科學基金項目（編號：81373421）

作者單位：1安徽省胸科醫院胸外科，合肥230022

作者簡介：華叢書，男，碩士；陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：chenxy＠ahmu．edu．cnMAPKs）信號轉導途徑是多種細胞的生存、凋亡信號傳導，p38通路通常介導細胞的凋亡。有關Res對肺癌的作用報道較少，該研究擬探討Res對人肺癌A549細胞增殖的影響，Res能否誘導A549細胞發生凋亡，及其與激活p38 MAPK信號轉導通路之間的關系。

Apoptosis induced by resveratrol in human lung cancer A549 cells and relation with p38 MAPK signal pathway

Hua Congshu，Chen Hai，Zhang Chaodong，etal
（Dept of Thoracic Surgery，Anhui Province Chest Hospital，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo study resveratrol（Res）-induced apoptosis in human lung cancer A549 cells and relation with mitogen-actived protein kinase（MAPK）signal pathway．MethodsCytotoxicity was analyzed by CCK-8method．Apoptotic cells were stained with Annexin V－FITC／PIand were detected by flow cytometry．Protein expressions of cleavage of the Caspases（Caspase-1，Caspase-3）and MAPK（p38，p-p38）were detected by Western blot analysis．ResultsRes inhibited proliferation of A549 cellswith IC50value of（10．6±1．2）μmol／L and induced cell apoptosis．Compared with the control group，apoptotic ratio increased rapidly within 24，36，48 h after Res （10μmol／L）treatment．Cleavage of the Caspase-1，Caspase-3 was observed in A549 cells treated with different doses of Res for 48 h．p38，p-p38 were activated．ConclusionRes inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells．Activation of p38 pathwaysmay be one of itsmechanisms．

Key wordsapoptosis；signal pathway；resveratrol；lung cancer A549 cells