食品中三聚氰胺的快速檢測方法

于燕燕，杜　峰，王　娜（.天津出入境檢驗檢疫局，天津300308；.國家知識產權局專利局專利審查協作天津中心，天津300308）

食品中三聚氰胺的快速檢測方法

于燕燕1，杜峰2，王娜1
（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津300308；2.國家知識產權局專利局專利審查協作天津中心，天津300308）

摘要：三聚氰胺是一種廣泛用于塑料、造紙和肥料的化工原料，若添加到食品中并長期被人們攝入會嚴重影響到身體健康。目前，用于三聚氰胺檢測的方法主要有：高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、氣相色譜-質譜法、電色譜儀檢測法等，但是，這幾種檢測方法均需要采用氮氣吹干儀，存在不能一次處理大量樣品、有毒氣體污染環境、消耗大量氮氣的技術問題。本文創新了一種新的檢測設備“真空離心濃縮儀”，同時優化了檢測方法，能夠快速檢測三聚氰胺，同時具有以下優點：可同時處理多個樣品而不會導致交叉污染；可以回收甲醇等有毒氣體，減少環境污染；回收的甲醇經蒸餾處理后可以重復使用，降低了成本。

關鍵詞：食品；三聚氰胺；真空離心濃縮；檢測技術

三聚氰胺（Melamine）簡稱三胺，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫藥等行業中。蛋白質的平均含氮質量分數為16．6%，而三聚氰胺的含氮質量分數高達66．6%。由于全氮法測定蛋白質含量時不能區分這種“偽蛋白氮”，所以一些不法商家將其添加到食品中以提高蛋白質含量。三聚氰胺不能被人體代謝，嚴重損害了消費者的健康和利益，尤其是兒童，服用三聚氰胺超標的食品，會導致腎結石[1-4]。“三鹿奶粉事件”導致大量兒童腎結石，以三鹿，蒙牛，伊利等為首的乳品企業均在其產品內檢出超標的三聚氰胺，一時間引起了人們對三聚氰胺的高度關注，隨之，國家取消了食品類商品免檢的待遇，這直接導致三聚氰胺的檢測量大增。

目前，國家標準GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測方法》規定了三聚氰胺的檢測方法[5]，實驗室檢測方法主要有：高效液相色譜法[6]、液相色譜-質譜法[7-9]、氣相色譜-質譜法等，奶制品中也有采用酶聯免疫吸附法檢測[10]。另外，目前一些檢測機構提出采用電色譜儀進行檢測[11]。針對這些檢測方法，液相色譜法的靈敏度較低，且分析時間較長，氣質、液質聯用儀，電色譜儀雖然檢測靈敏度和分辨率很高，但是，這幾種檢測方法均需要采用氮氣吹干儀，氮氣吹干儀處理三聚氰胺樣品雖然能夠較快的處理樣品，但是，氮氣吹干儀一次只能處理少量樣品，增加了檢測時間，無法滿足目前大量檢測樣品需同時檢測的需求；從試管內被氮氣吹掃而揮發出來的有機溶劑不經任何處理，直接散發到周圍環境中，這些溶劑常常是強酸、強堿以及強腐蝕性物質。直接操作的實驗人員極易因此出現健康問題，而這些溶劑揮發到空氣里，也會對周圍環境造成危害，包括辦公室工作人員，周圍綠化等。蒸汽會腐蝕儀器（針頭），導致交叉污染；另外，氮氣吹干儀本身于由于長期處在這種環境中，也會很快出現生銹等被腐蝕現象，雖然有些氮氣吹干儀的設計將針頭包上一層PTFE以防腐，但針的尾部和儀器其它部件無法全部包上PTFE，不僅影響美觀、性能，而且在操作時稍有不慎，便會將鐵銹等碰落到樣品中，造成樣品污染；氮氣吹干操作麻煩，必須有人一直看守，增加了檢測人員的負擔；消耗大量氮氣，增加檢測成本。由此可見，改進氮氣吹干儀在三聚氰胺檢測中的缺陷是非常必要的[12]。

本文創新了一種新三聚氰胺的檢測設備“真空離心濃縮儀”，同時優化了檢測方法，解決了目前檢測方法存在的不能一次處理大量樣品，有毒氣體污染環境，消耗大量氮氣的技術問題。

1　試驗部分

1.1儀器與試劑

安捷倫7890A/5975C氣相色譜-質譜檢測系統（配備混合型陽離子交換固相萃取柱）：美國安捷倫公司；CHRIST SpeedDry 2-33IR真空離心濃縮儀：德國CHRIST公司。

乙酸鉛（分析純）、三氯乙酸、甲醇（色譜級）、優純級吡啶、N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷、三聚氰胺，以上試劑均由天津化學試劑有限公司提供。1.2試驗條件

GC-MS色譜條件：色譜柱：5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；流速：1.0 mL/min；程序升溫：70℃保持1min，以10℃/min的速率升溫至200℃，保持10 min；傳輸線溫度：280℃；進樣口溫度：250℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；電離方式：電子轟擊電離（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描模式：選擇離子掃描，定性離子m/z 99、171、327、342，定量離子m/z 327。

1.3方法

1.3.1三聚氰胺標準溶液配制

三聚氰胺標準儲備液的配制：準確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標準品于100 mL容量瓶中，用質量分數為50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于4℃避光保存。

三聚氰胺標準溶液的配制：取三聚氰胺標準儲備液0.01、0.02、0.2、0.4、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用質量分數為50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配成質量濃度為1.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L的標準溶液，于4℃冰箱內儲存，有效期3個月。

1.3.2樣品的提取

液態奶、奶粉、酸奶和奶糖等稱取5.00 g樣品于50 mL具塞比色管，加入30 mL濃度1%（質量分數）的三氯乙酸溶液，渦漩振蕩40 s以上，再加入10 mL濃度1%（質量分數）三氯乙酸溶液，超聲提取20 min以上，加入2 mL、濃度22 g/L的乙酸鉛溶液，用1%（質量分數）三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混勻后，轉移上層提取液29 mL～32 mL至50 mL的離心試管，以5 000 r/min離心15 min以上，得到待凈化的上清液。

奶酪、奶油和巧克力等稱取5.00 g樣品于50 mL具塞比色管中，用5 mL熱水溶解或者在加熱的條件下溶解，再加入25 mL濃度1%（質量分數）的三氯乙酸溶液，渦漩振蕩40 s以上，再加入10 mL三氯乙酸溶液超聲提取20 min以上，加入2 mL、濃度22 g/L的乙酸鉛溶液，用1%（質量分數）三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混勻后，轉移上層提取液29 mL～32 mL至50 mL的離心試管，以5 000 r/min離心15 min以上，得到待凈化的上清液。

1.3.3上清液的凈化

取基質為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物的混合型陽離子交換固相萃取柱，先依次用3 mL～4 mL甲醇、5 mL～6 mL水活化；移取5 mL的待凈化濾液至固相萃取柱中。再用3 mL～5 mL水、3 mL～5 mL甲醇淋洗，淋洗液送入回收裝置，抽近干后用3 mL～5 mL體積分數5%的氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；所述氨化甲醇是5 mL摩爾濃度為25%～28%的氨水和95 mL甲醇，混勻后備用。

1.3.4離心濃縮

將12～24份（樣品量調整到偶數，單數量樣品可以用空的離心管配級成偶數）樣品收集得到的洗脫液同時放入到真空離心濃縮儀的離心管中，進行真空離心干燥，在真空狀態下輻射加熱樣品；并利用真空離心濃縮儀的冷阱捕捉溶劑蒸氣，冷卻，回收，送入回收裝置。

所述真空離心濃縮儀主要由：離心主機、冷阱、真空泵三部分組成，這算是一種在真空狀態下離心樣品，從而將溶劑蒸發以濃縮或干燥樣品的儀器。并通過超低溫的冷阱捕捉溶劑。離心濃縮后的樣品可方便的用于各種定性和定量的分析。離心濃縮技術融合了離心、抽真空和熱量3種因素，用于有效的蒸發各種溶劑。

離心：轉速1 000 r/min，防止爆沸及樣品的損失。干燥后的溶質完全沉積在容器的底部，便于樣品的完全回收。

抽真空：加速溶劑在SpeedVac濃縮儀中的蒸發。在濃縮過程中，樣品始終處于一種低于室溫的環境，可以防止熱敏感樣品的部分失活。此外，真空狀態還能防止樣品的氧化。

熱量：加速樣品的蒸發速率。在沒有外來熱量的狀態下，水溶液會在濃縮過程中結冰，本設備采用輻射加熱技術，彌補蒸發時的熱量損耗。熱輻射是真空狀態下給樣品加熱的最有效方式。

1.3.5衍生化

取上述干燥殘留物，加入600 μL的優純級吡啶和200 μL衍生化試劑，混勻，70℃反應40 min以上；所述衍生化試劑是由體積比99∶1的N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS），其中所述衍生化試劑是色譜純的。

1.3.6三聚氰胺的定量檢測

稱取樣品5 g按上述方法處理后進行空白試驗，取樣品5 g加入適量三聚氰胺標準液處理后按上述方法進行GC-MS測定，以標準工作溶液濃度為橫坐標，定量離子質量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。比對標準曲線，即得到樣品中三聚氰胺的含量。

2　結果分析

2.1標準曲線

對濃度為1.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L的三聚氰胺標準溶液分別進樣，以標準溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1）。

圖1　標準溶液的標準曲線Fig.1　The standard curve of the standard solution

三聚氰胺在1.0 mg/L～100 mg/L濃度范圍內線性關系良好，回歸方程：y=39.24x+5.056 7（y為樣品峰面積，x為樣品濃度），相關系數r=0.999 8。

2.2方法的準確度及精密度分析

稱取空白牛奶5 g進行空白試驗，加入3個不同濃度的三聚氰胺標準液處理后進行分析，每個樣品重復分析3次，回收率范圍89.0%～105.0%，相對標準偏差3.14%～4.97%，其準確度與精密度均符合殘留分析的要求。樣品添加回收率見表1。2.3甲醇回收率試驗

表1　方法回收率試驗Table 1　The average recoveries of the rapid screening method

稱取不同量奶粉，按照本文方法處理，分別使用5、20、50 mL的甲醇進行處理，得到洗脫液放入到甲醇蒸餾裝置中，得到純化的甲醇，甲醇的回收率在85%（質量分數）以上，重復利用率為80%（質量分數）以上。

3　結論

采用本文所述方法檢測三聚氰胺具有以下優點：

a）真空濃縮儀綜合利用離心力、加熱和外接真空泵提供的真空作用來進行溶劑蒸發，可同時處理多個樣品而不會導致交叉污染。

b）冷阱能有效捕捉大部分對真空泵有損害的溶劑蒸氣，對高真空油泵提供有效的保護。

c）真空泵使系統處于真空狀態，降低溶劑的沸點，加快溶劑的蒸發速率。

d）可以同時處理大量樣品，最大可以同時處理24份樣品，并可同時處理多種樣品。

e）可以回收甲醇，最大可能的降低環境污染，回收的甲醇經蒸餾處理后可以重復使用，甲醇的重復利用率達80%以上，降低了成本。

參考文獻：

[1]Venkatasami G,Sowa Jr J R.A rapid acetonitrile-free,HPLC method for determination of melamine in infant formula[J].Analytiea Chimica Acta,2010,665(2):227-230

[2]Cheng Y,Dong Y Y,wu J H,et al.Screening melamine adulterant in milk powder with laser Raman spectrometry[J].Journal of Food Composition and Analysis,2010,23(2):199-202

[3]Jawaid S,TalpurFN,Sherazi S TH,et al.Rapid detection ofmelamine adulteration in dairy milk by SB--ATR-·Fourier transform infrared spectroscopy[J].Food Chemistry,2013,141(3):3068-3071

[4]何橋桑,劉敏芳,黃麗英,等.高效液相色譜法測定奶粉和液態奶中的三聚氰胺[J].色譜,2008,26(6):753-754

[5]中國檢驗檢疫科學研究院、國家食品質量安全監督檢驗中心. GB/T 22388—2008原料乳和乳制品中三聚氰胺的檢測方法[S].北京:中國標準出版社,2008

[6]Li Y,Hao W,Wang Y,et al.Determination of melamine and ammelinein eggs and meat using hydrophilie intemction liquid chromatograph[J].se Pu,2012,30(7):716-720

[7]Smoker M,Krynitsky A J.Interim method for the determination of melamine and cyanuric acid residues in foods using LC-MS／MS: Version 1.0[R].U S Food and Drug Administration,2008

[8]Andersen W C,Turnipseed S B,Karbiwnyk C M,et al.Determination and confirmation of melamine residues in catfish,trout,tilapia, salmon,and shrimp by liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J].J Agric Food Chem,2008,56(12):4340-4347

[9]Tittlemier S A,Lau B P Y,Menard C,et al.Melamine in infant formula sold in Canada:occurrence and risk assessment[J].J Agric Food Chem,2009,57(12):5340-5344

[10]Zhou Y,Li C Y,Li Y S,et al.Monoclonal antibody based inhibition ELISA as a new tool for the analysis of melamine in milk and pet food samples[J].Food Chem,2012,135(4):2681-2686

[11]Liu F,Yang X,Sun S.Determination of melamine based on electro chemiluminescence of Ru(bpy)32+at bare and single-wall carbon nanotube modified glassy carbon electrodes[J].Analyst,2011,136(2): 374-378

[12]Wang Z,Ma X,Zhang L,et al.Screening and determination of melamine residues in tissue and body fluid samples[J].Ana1 Chim Acta,2010,662(1):69-75

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.038

收稿日期：2015-05-15

基金項目：獲得授權發明專利：ZL201210402734.3一種三聚氰胺的檢測方法；實用新型專利：ZL201220540231.8一種三聚氰胺的檢測裝置

作者簡介：于燕燕（1981—），女（漢），中級工程師，碩士研究生，主要從事出入境檢驗檢疫工作。

Research of Rapid Detection of Melamine in Food

YU Yan-yan1，DU Feng2，WANG Na1
（1.Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China；2.Patent Examination
Cooperation Tianjin Center of The Patent Office，SIPO，Tianjin 300308，China）

Abstract：Melamine is widely used as raw material in various industries including plastics，papers and fertilizers，which can do harm to people's health if it is added to food.These incidents have promoted the development of various methods for detecting melamine in many kinds of food products，including highperformance liquid chromatography，gas chromatography，liquid chromatography-mass spectrum，gas chromatography-mass spectrum，and capillary electrophoresis，etc.However，Termovap Sample Concentrator is Indispensable for these detection measurements in which with the consuming large amounts of nitrogen and lacking the ability of dealing with large numbers of samples simultaneously and generating toxic gases byproduct which will pollute the environment.A new detection equipment"vacuum centrifugal concentrator"was innovated in this paper，while the detection method was optimized.This method can realize the rapid detection of melamine，also has the following advantages：it can simultaneously process a plurality of samples without cross contamination；methanol and other toxic gases can be recycled to reduce environmental pollution，recycling methanol can be reused after distilled treatment，by which can also reduce the cost.

Key words：food；melamine；vacuum centrifugal concentration；detection method