不同酵母對蘋果啤酒發酵及風味的影響

韓 東,李 紅,景建洲

(1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.中國食品發酵工業研究院,北京 100015;3.中德發酵酒品質與安全國際聯合研究中心,北京 100015)

不同酵母對蘋果啤酒發酵及風味的影響

韓 東1,2,3,李 紅2,3,景建洲1,*

(1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院,河南鄭州 450002;2.中國食品發酵工業研究院,北京 100015;3.中德發酵酒品質與安全國際聯合研究中心,北京 100015)

在同種工藝條件下,以實驗室保藏的5株釀酒酵母(A、B、C、D和E)及歐洲進口的5株活性干酵母(S04、S23、S33、S189和安琪)為出發菌,測定了發酵過程中發酵速度、α-氨基氮(α-AN)、主酵結束后風味物質、有機酸和可發酵性糖等指標,并系統地比較了不同酵母的發酵性能和風味。結果顯示,菌株S23發酵速度較快,發酵液中高級醇、乙酸和可發酵性糖的含量較低,分別為56.12 mg/L、62.86 mg/L和0.62 mg/L,檸檬酸的含量較高為194.46 mg/L。研究表明菌株S23的綜合性能最佳,具有應用于蘋果啤酒生產的潛能。

釀酒酵母,發酵性能,風味物質

啤酒是一種低酒精度飲品,深受消費者喜愛。但是,近些年來啤酒市場的競爭日益激烈,消費者的口味也趨于多元化,因而用于釀酒的原輔料越來越豐富。其中以蘋果汁為輔料生產的蘋果啤酒就是一款新興的啤酒產品。現在研究發現,蘋果汁中含有大量的維生素、氨基酸和礦物質,具有很高的營養價值[1]。故將蘋果汁與麥汁混合發酵生產出既能保持啤酒的固有風格,又能突出蘋果的獨特口味的具有一定營養保健功能的蘋果啤酒[2],是消費者要求啤酒“低濃度、低酒精、功能性、果味型發展”的必然需要,對推動我國果品產業化及飲料酒市場、特別是低度酒市場的發展具有重要意義[3]。因此開發成本低廉,資源、營養豐富的蘋果啤酒勢在必行。

釀酒酵母是影響蘋果啤酒品質的重要因素之一,其選擇直接影響了蘋果啤酒的質量[4-6]。鄭莉燁等研究了四種具有不同遺傳背景的下面酵母(Saccharomycespastorianus,FBY0095、FBY0096、FBY0097和FBY0098)在12°P正常濃度與24°P超高濃度麥汁中發酵性能的差異,結果表明,正常濃度發酵條件下,啤酒酵母FBY0095和FBY0098具有良好的發酵特性;而超高濃度條件下,啤酒酵母FBY0097和FBY0098表現出了較好的發酵性能[7]。嚴紅光等利用頂空固相微萃取結合氣質聯用儀分析3種酵母菌釀造的藍莓酒中主要香氣物質,研究結果顯示酵母菌種是影響果酒香氣物質組成的關鍵因素之一[8]。Williams等用蘋果酒酵母發酵無菌糖溶液,得到的發酵液中含有一系列的醇類、醛類和酯類,其中大部分都能在同種酵母發酵的蘋果酒中找到[9]。Pollard用蘋果汁比較了人工酵母(Port350R)發酵的蘋果酒和天然酵母發酵的蘋果酒中高級醇含量,發現天然酵母發酵的蘋果酒所產的高級醇、2-苯乙醇含量均比人工酵母發酵的蘋果酒高[10]。上述主要研究了酵母的性能及產香特性。這是由于不同的酵母菌株有著不同的生理特性,其代謝副產物的種類及含量均有差異的緣故。

目前,我國蘋果啤酒的發展起步較晚,對蘋果啤酒酵母的研究較少,主要通過從自然中初步分離篩選出發酵性能較好的蘋果啤酒酵母。然而,這些酵母發酵性能的不足,尚不能適應商業化生產。本研究針對10株釀酒酵母的發酵性能、產酒理化性質和主要風味成分進行系統研究,篩選出適宜蘋果啤酒釀造的釀酒酵母,旨在推動飲料酒產業的發展,同時為構建特色型蘋果啤酒酵母提供優良親本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)A、B、C、D和E 中國食品發酵工業研究院提供;S04和S33 ALE酵母、S23和S189 LARGER酵母 歐洲進口活性干酵母;安琪果酒酵母 安琪酵母有限公司;大麥芽(澳麥) 燕京啤酒有限公司提供;蘋果濃縮汁 煙臺金潮食品有限公司提供;無水葡萄糖(純度99.8%) 美國sigma公司;D-果糖、蔗糖(純度99.5%) Biotopped公司;麥芽糖、麥芽三糖(HPLC) 美國sigma公司;乙腈(色譜純);檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、富馬酸(均為色譜純) 美國Sigma公司;乙醛、DMS、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯(純度均≥95.0%) Acros公司和Sigma-Aldrich公司。

高效液相色譜儀 日本島津公司;氣相色譜儀 美國PerkinElmer公司;ICS-3000型離子色譜 美國戴安公司;KQ100-DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;萬分之一天平 日本島津公司;低溫恒溫水浴鍋 杭州雪中炭恒溫技術有限公司;LRH-250生化培養箱 上海一恒科技有限公司;UV1780 紫外可見分光光度計 日本島津公司;PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 菌株活化 實驗室酵母的活化:取1環斜面酵母轉接到麥汁斜面培養基上,30 ℃培養24 h;干酵母的活化:取約1 g干酵母,用20 mL 5%糖水30 ℃活化30 min。

1.2.3 酵母擴大培養 酵母的一級擴大培養:將活化菌種轉接于10 mL液體麥汁培養基中,在30 ℃下一級擴大培養24 h。

酵母的二級擴大培養:再轉接于100 mL液體麥汁培養基中,在30 ℃下擴大培養24 h。通過血球計數板對酵母讀數,直至菌體濃度達到107個/mL以上,作為種子液備用。

1.2.4 酵母發酵力實驗 按10%的比例,將擴大培養的酵母分別接入到100 mL麥汁和蘋果汁混合液(麥汁∶蘋果汁=7∶3)中[11],10 ℃發酵,每24 h稱重,至2次失重之差小于0.2 g為發酵終點。繪制發酵醪失重與時間曲線,比較各酵母發酵速度的大小[12]。

1.2.5 理化指標測定 酒精度以密度瓶法測定,參照GB/T 4928-2008;總酸利用指示劑法測定,參照GB/T 4928-2008;α-氨基氮利用比色法測定,參照GB/T 1686-2008;總糖利用蒽酮比色法測定[13-14]。

1.2.6 風味物質測定 待測樣品在超聲波儀器里超聲脫氣30 min,測試樣品需在室溫下平衡后,取樣品5 mL注入進樣瓶中,放入自動進樣盤中。發酵液樣品直接進樣進行風味物質[15]含量的測定。

1.2.7 有機酸測定 樣品液超聲脫氣后,用移液管移取1.0 mL,用超純水稀釋至10.0 mL并搖勻,用過濾器過濾后作為試液。分別取樣品液3.0～5.0 mL注入進樣瓶中,通過自動進樣盤直接進樣,根據保留時間定性,用峰面積按外標法定量。

1.2.8 可發酵性糖測定 待測發酵液樣品在超聲波條件下脫氣30 min,測試樣品需在室溫下平衡,取樣品1 mL,經0.45 μm微孔膜過濾器注入離心管中。發酵液樣品直接進樣進行葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖含量的測定[16],以上各實驗的進樣量均為5 μL。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵性能的對比

2.1.1 酵母菌株發酵力實驗 酵母菌的發酵力是反映酵母對各種糖類的發酵能力的重要指標。酵母的酶系不同,發酵糖的能力也不同,發酵過程中除產生乙醇外,還伴有二氧化碳形成;形成的二氧化碳從發酵體系中逸出,使整個體系的重量減輕,根據減輕的程度,可以判斷發酵速度的快慢;在釀酒工業中,酵母菌的產酒能力要求較高,因此發酵力也就成為衡量酵母產酒能力的一個重要指標[17]。

酵母菌株發酵力測定結果見圖1A和圖1B。從圖1A中可以發現:A和D發酵力比B、C、E發酵力強,并且在第3 d時CO2失重量達到了最大值,具有較強的發酵性能;從圖1B中可以看出:5種活性干酵母起酵較快,其中S04和S23發酵速度比S33、S189和安琪發酵快,具有較好的發酵力。因此,不同酵母菌株在相同濃度麥汁中的發酵性能有顯著差異,這是因為不同的菌株其遺傳背景不同的緣故。

圖1 不同酵母菌株發酵速度的比較Fig.1 The comparison of different yeaststrains fermentation speed

2.1.2 酵母發酵液的理化指標 我國GB/T4927-2008規定11°P啤酒的酒精度含量不低于3.2%,真正濃度不低于3.9%。從表1可看出,S04、S23和S189酵母酒樣均符合規定。就真正發酵度而言,酵母發酵液的發酵度存在顯著差異,且相關的研究發現成品酒的發酵度在62%～68%之間時酒樣口味協調,香氣典型,因此S04、S23和S33酵母酒樣較好。由于發酵液是由蘋果汁和麥汁混合液發酵而成,因此10株酵母釀造的蘋果啤酒總酸含量均高,其中S04酒樣顯著低于其他。

表1 不同酵母菌株發酵液的理化指標

注:
注:n=3,同列數據尾注不同字母表示在p<0.05時有統計學差異。

2.1.3 酵母菌株發酵過程中α-氨基氮含量的變化 從圖2A可以看出:蘋果麥汁發酵液中α-氨基氮含量隨發酵時間逐漸降低,前4 d下降較快,后4 d趨于平緩。說明前4 d的酵母代謝活動較后4 d旺盛。主酵結束后,α-氨基氮的同化率強弱順序:C>E>D>A>B,這表明C利用α-氨基氮的能力較強,其活性較高。從圖2B可以看出:發酵液中α-氨基氮含量隨發酵進行呈下降趨勢,其中安琪酵母的α-氨基氮含量下降速度最快,S189下降速度最慢。主酵結束后,α-氨基氮的同化率強弱順序:安琪>S04>S33>S23>S189,說明安琪酵母的同化率較強,其活性較高。這是由于隨著發酵的進行,酵母吸收利用發酵液中的營養物質,發酵前期酵母生長繁殖較快,對營養的需求量大的緣故。

圖2 不同酵母菌株發酵過程中α-氨基氮含量的變化Fig.2 The change of alpha amino nitrogen contentof different yeast strains in the fermentation process

2.2 不同酵母對發酵液風味的影響

2.2.1 酵母菌株發酵液風味物質含量對比 發酵酒的風味物質主要來自于原料和發酵過程中酵母的代謝產物[18]。其中高級醇和酯是發酵酒的主要香味和口味物質,能使酒體具有豐滿的香味和口味,并增加酒體的協調性。但含量太高會破壞酒體及風味的協調,給酒體帶來異香或異雜味。

由圖3A可知:菌株E、S189和安琪發酵酒液中乙醛含量均超過界限值10 mg/L[19],會給人以粗糙苦味感。10種不同酵母的發酵酒液中正丙醇、異丁醇和異戊醇的含量均未超過其閾值,其中正丙醇和異丁醇含量差別不明顯,而異丁醇的差別顯著,酵母S189發酵液中異丁醇的含量最高為64.3 mg/L,酵母S23含量最低為33 mg/L。表明酵母菌株的種類不同,發酵酒中高級醇的含量有不同程度的差異。同時,大量研究結果表明,酵母菌種對啤酒高級醇的形成起決定性作用。

由圖3B可知:10種不同酵母的發酵酒液中甲酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯含量符合正常啤酒的范圍;菌種S04、S189和安琪發酵酒液中乙酸乙酯含量低于正常啤酒的范圍;菌種S23和安琪發酵酒液中辛酸乙酯含量低于正常啤酒的范圍。菌種A和E發酵液中甲酸乙酯含量較多;菌種C發酵液中乙酸異戊酯的含量相對較多;菌種D發酵液中己酸乙酯含量較多;整體看A、C和D酵母發酵液酯類含量相差不大,都有增香的作用;活性干酵母S33發酵液中4種酯類含量都很高。這說明A、C、D和S23在產酯類方面有很大的優勢。這可能是因為不同菌株細胞內酯酰輔酶A的活性和產量均不同,從而生成的酯的能力也不同。

圖3 不同酵母菌株發酵液中風味物質含量對比Fig.3 The comparison of different yeast strainsflavor substances contents in the fermented liquid

由圖4可知:菌種E發酵液中總揮發酯含量最多為15.4 mg/L,而菌種S04發酵液中總揮發酯含量最少為6.4 mg/L;菌種E發酵液中總高級醇含量最多為96.3 mg/L,而菌種S23發酵液中總高級醇含量最少為56.1 mg/L。其中菌種E發酵液中總揮發酯和總高級醇含量均是最高的,如果單純通過醇酯含量對酵母菌株進行比較,分析起來比較困難,因此要進行醇酯比分析。實驗室菌種A、C和E發酵液的醇酯比較低,活性干酵母S23發酵液的醇酯比較低,這說明就風味上來說,菌種A、C、E和S23發酵液口感更協調、更純正。這可能是因為酵母菌株本身之間存在著差異,則不同菌種發酵所得到的風味物質含量有所差異。

圖4 不同酵母菌株發酵液中醇酯含量及醇酯比Fig.4 The comparison of alcohol ester content andalcohol ester ratio of different yeast strainsin the fermented liquid

2.2.2 酵母菌株發酵液有機酸含量對比 由圖5A和5B可知,發酵液中酵母菌產生的總有機酸范圍為1959～1172 mg/L;其中10株酵母菌株發酵液中乙酸含量差別較大,D菌株發酵液含量最低僅為45.8 mg/L,然而S04菌株發酵液含量最高可達到310.2 mg/L,相差近6倍;酵母菌株發酵液中檸檬酸含量差別較小,多數組的含量為190 mg/L左右,S04菌株的含量最低為80.1 mg/L,C菌株的含量最高為110.3 mg/L。這是因為不同酵母菌種在有機酸的代謝能力上差別很大,因此會造成不同酵母品種發酵液中有機酸組成和含量比關系上的區別,進而形成不同的風味類型。

圖5 不同酵母菌株發酵液有機酸含量的對比Fig.5 The comparison of organic acids contentof different yeast strains fermented liquid

乙酸含量過高容易造成酒類酸味露頭,琥珀酸有特殊的苦味和咸味,致使酒類酸感不協調,而檸檬酸清新爽口,有利于酒類風味的形成。通過比較發現,D酵母產乙酸較少,且發酵液中有利于飲料酒風味的檸檬酸含量較多;同理S23酵母發酵液中檸檬酸含量較多,然而乙酸較少,有利于酸味協調。

2.2.3 酵母菌株發酵液中可發酵性糖含量對比 糖類是酒類釀造過程中非常重要的一類風味物質,因此酵母利用糖類物質的情況,對穩定和控制酒類的質量具有重要意義[20]。由圖6可知:主酵結束時,酵母對果糖消耗較大,對麥芽三糖的利用速度較麥芽糖相對緩慢。正常情況下,酵母菌株在發酵的過程中對單糖的利用較為徹底;然而如圖6所示:葡萄糖有部分殘留,這是由于在發酵過程中,酵母主要利用了蘋果汁中的蔗糖,而對果糖、葡萄糖有所積累,在很大程度上改善了蘋果麥汁發酵液的口感。從整體上看酵母D可發酵性糖含量較少,說明D酵母對可發酵性糖的利用較徹底;S23酵母可發酵性糖含量較少,說明S23酵母對可發酵性糖的利用較徹底。這是由于酵母菌株的種類不同,其代謝糖的能力也不同,對可發酵性糖的利用能力也不同。

圖6 不同酵母菌株發酵液糖含量的對比Fig.6 The comparison of sugar contents ofdifferent yeast strains fermented liquid

3 結論

3.1 十株酵母菌株發酵性能實驗結果表明,酵母菌株的發酵力都各有明顯差異,其中酵母菌株A和D的發酵力比菌株B、C和E強;活性干酵母S04和S23的發酵力比菌株S33、S189和安琪強。S04和S23酵母發酵所得原酒的酒度、酸度和真正發酵度均符合啤酒國家標準(GB/T4927-2008)。酵母菌株在發酵的過程中,發酵液中α-氨基氮的含量不斷減少;主酵結束后,α-氨基氮含量變化趨于平緩,且C酵母和安琪酵母對α-氨基氮的利用率最強。

3.2 不同酵母菌株發酵液風味結果表明,香氣物質含量在一定的范圍內,酵母菌株的發酵液高級醇含量越低,總揮發酯越高,其發酵酒體協調,香氣純正。根據醇酯比的大小分析發酵酒液,實驗室酵母醇酯比普遍低于活性干酵母;活性干酵母S23的醇酯比較低,其發酵酒協調,香醇。有機酸是酒類重要的呈味物質,不同的酵母其發酵液的有機酸含量各有不同。D酵母和S23酵母檸檬酸含量較多,且乙酸含量較少,能夠使發酵液具有協調的口感。酵母菌株是通過消耗可發酵性糖來進行發酵,從對糖類的利用情況可以看出:D酵母和S23酵母對可發酵性糖的利用速率較快,其吸收較為徹底。

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Effects of different yeasts on apple beer fermentation and flavor

HAN Dong1,2,3,LI Hong2,3,JING Jian-zhou1,*

(1.School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.China national Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China;3.Sino-Germany United Research Center of Fermented alcohol Quality Safety,Beijing 100015,China)

Under the conditions of same process,five strains ofSaccharomycescerevisiae(A,B,C,D and E)were preserved from the laboratory and five strains of active dry yeasts(S04,S23,S33,S189 and Angel)were imported from the European as the starting bacteria,the speed of fermentation and the contents of α-AN during the fermentation process and flavor substances,organic acids,fermentable sugars after the primary fermentation were studied,and the comparison on fermentation performance and flavors of different yeasts were systematically carried on. The results showed that the strain S23 had the faster fermentation speed,moreover,the contents of higher alcohol,acetic acid and fermentable sugars were lower in the fermented liquid of S23 strains,their contents were 56.12 mg/L,62.86 mg/L and 0.62 mg/L,the more contents of citric acid were 194.46 mg/L. The study were as follows:the strain S23 had the best comprehensive performance,and had the potential in the application of the apple beer production.

Saccharomycescerevisiae;fermentation performance;flavor substances

2014-10-08

韓東(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：釀酒技術，E-mail：orange_1101@126.com。

*通訊作者:景建洲(1964-)，男，博士，教授，研究方向：植物基因工程和食品安全檢測，E-mail：821952650@qq.com。

國家國際科技合作專項項目(2014DFG31770)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0179-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.030