散發型嗜鉻細胞瘤易感基因的熱點區域的篩選

王 棟，李漢忠

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 泌尿外科, 北京 100730)

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研究論文

散發型嗜鉻細胞瘤易感基因的熱點區域的篩選

王 棟，李漢忠*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 泌尿外科, 北京 100730)

目的篩選與散發型嗜鉻細胞瘤易感基因相關的染色體區域。 方法收集北京協和醫院2011年9月至2013年5月臨床診斷的42例散發型嗜鉻細胞瘤病例。提取嗜鉻細胞瘤及外周血的基因組DNA，用Sanger測序法檢測遺傳型嗜鉻細胞瘤的突變基因；在證實為散發型的部分病例中，用單核苷酸多態性芯片(SNP 6.0 芯片)對其腫瘤組織及外周血的基因組進行掃描分析，精確定位可能的熱點區域；然后以Q-PCR技術在其余的病例中進一步驗證，從而最終確定散發型嗜鉻細胞瘤相關的染色體片段。結果38例散發型病例，4例遺傳型病例。通過SNP 6.0芯片掃描發現染色體片段的缺失較擴增更為常見，缺失的染色體包括 1p、3q、17p、22q和11p。1p上的chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471和chr1:98 902 091～107 622 4303個片段的缺失最為常見；Q-PCR驗證后，上述3個片段仍為最常見的缺失區域。4例Ret突變者均出現上述3個片段的缺失。結論1號染色體短臂的部分區域上可能存散發型嗜鉻細胞瘤相關的抑癌基因。

散發型嗜鉻細胞瘤；單核苷酸多態性芯片；基因

嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma, PCC)因分泌過量兒茶酚胺，可導致嚴重的心腦血管并發癥，同時對于惡性PCC的診斷和治療也缺乏理想的方法[1]。因而，明確PCC的發病機制，找到相關的突變基因以協助診斷及治療就顯得尤為迫切。目前發現NF1、RET、SDHx、TEME127以及MAX是遺傳型PCC的易感基因[2]。但對于占多數比例的散發型PCC，雖有部分病例與上述基因相關，但仍有80%左右的病例其發病機制仍不明確[3]。基因芯片(gene chip)可在短時間內對全基因組進行掃描，具有快速、精確和低成本的分析檢驗能力，其中最新的單核苷酸多態性(sing1e nucleotidepolymorphism，SNP)芯片分辨率高，且能夠同時檢測DNA片斷的擴增和缺失(copy-number variation, CNV)與等位基因的雜合性缺失(loss of heterozygosis, LOH)，在相關基因篩選中的應用越來越廣泛[4]。

1 材料與方法

1.1 病例和腫瘤標本

2011年9月至2013年5月共納入臨床診斷的散發型嗜鉻細胞瘤42例，所有病例均無遺傳性內分泌腫瘤綜合征的家族史，且均未發現NF1、VHL綜合征、多發性內分泌腫瘤病2型(MEN 2)及家族性嗜鉻細胞瘤/副節瘤綜合征伴隨的其他腫瘤的證據。其中女性18人，男性24人，中位年齡43歲(17～61歲)，單側腫瘤39例，雙側腫瘤3例，腎上腺外9例，腎上腺區33例(表1)。

組織來源于手術切除的腫瘤標本和外周血。腫瘤標本離體后立即切割成直徑1～2 mm的組織塊，經液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中保存。手術當日術前取頭靜脈血2.5 mL，放入肝素抗凝管內，置-80 ℃冰箱，作為腫瘤組織的正常配對。

表1 臨床資料

A.adrenal; EA.extra-adrenal; NE.norepinephrine; E.epinephrine; D.dopamine; B/M.benign/malignant; Bi/Mono.bilateral/monolateral.

1.2 基因組DNA的提取和質量控制

應用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取全血基因組DNA，應用QIAamp DNA Mini Kit提取腫瘤組織基因組DNA，均按生產商的說明進行操作。應用于芯片實驗的基因組DNA樣本必須符合以下質控條件：用Nanodrop分光光度計檢測吸光度，A260/A280應接近1.8，濃度大于500 μg/μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳出現1條明亮單1條帶，無明顯拖尾。

1.3 Sanger測序

PCR擴增血液及腫瘤組織基因組DNA中各個PCC相關基因(RET，VHL，SDHB，SDHC和SDHD)的外顯子片段，應用Sanger測序檢測是否存在這些基因的突變。MEM127和MAX突變在PCC患者中的比例低于1%，因而未檢測這兩種基因，而NF1因可通過特異臨床的表現而排除，故也未檢測NF1的突變。

1.4 SNP芯片檢測及熱點區域的初步定位

在證實為散發型的病例中，應用SNP6.0芯片(Affymetrix公司提供)掃描隨機抽取的14例患者的基因組DNA(包括腫瘤組織和外周血的白細胞)。實驗過程按照Affymetrix? Genome-Wide Human SNP Nsp/Sty 6.0 User Guide芯片實驗操作手冊進行。

前述程序結束后，以3000 7G掃描儀掃描芯片，將原始數據文件輸入到Partek Genomics Suite 軟件，腫瘤樣本的拷貝數以配對的外周血為基線進行分析，拷貝數大于2.3和小于1.6分別作為擴增和缺失的標準，其中技術參數嚴格限制：基因組marker數>10；P<0.001；信噪比>0.3。選取CNV頻率最高的染色體片段作為相關的熱點區域進行進一步驗證。

1.5 Q-PCR驗證染色體易感區域

通過Q-PCR在其余的散發型病例中驗證SNP6.0芯片所初步確定的熱點區域。首先根據NCBI Genebank及相關文獻，確定熱點區域所對應的DNA序列，進而設計出引物。然后配制Q-PCR反應體系，進行PCR反應。Q-PCR反應在StepOne Plus實時熒光定量PCR儀上進行(表2，表3)。以全部血液基因組DNA的混合物為拷貝數正常對照樣本。以C2基因片段作為標化序列，應用2-ΔΔCt法計算相對拷貝數。將擴增的PCR產物進行溶解曲線分析判斷擴增產物的特異性。相對拷貝數小于1.4認定為發生缺失。為使Q-PCR產物能代表所檢測的DNA片段，為每個片段分別設計3組引物。同一樣本3組引物的結果一致可認定為發生缺失。

表2 配制的Q-PCR反應體系

表3 Q-PCR擴增反應條件

使用StepOneTM軟件(熒光定量操作及數據分析軟件)對數據進行處理。將超過全部散發型病例數50%的區域確定為散發型PCC相關的染色體區域。臨床數據與CNV片段之間的關聯通過χ2檢驗來驗證。

2 結果

2.1 基因組DNA提取結果

腫瘤及外周血白細胞DNA的凝膠電泳顯示DNA條帶清晰單一，吸光度A260/280比值均在1.7～1.9之間，證實提取的基因組DNA為高純度、無降解(圖1)。

2.2 Sanger測序的結果

42例病例中，4例外周血的突變檢測為陽性，其中1例為VHL突變，3例為RET突變(圖2)。其余38例外周血突變檢測的結果均為陰性，證實為散發型PCC，其中1例(41號)腫瘤組織的RET基因顯示為陽性。

圖1 部分病例中腫瘤組織與外周血的基因組DNA凝膠電泳結果

A,B,C. Sequencing consequences of DNA products from blood tissues indicated a heterozygous G/A mutation at codon 634, which was consistent with the results of DNA from tumor tissues sequencing; D. Sequencing consequences of DNA products from tumor tissues indicated a heterozygous C/A mutation at codon 618, which was not conformed in the results of DNA from blood tissues sequencing

圖2 Sanger測序的結果(ret基因)

Fig 2 The result of Sanger sequence mutation in ret gene

2.3 染色體熱點區域的初步確定

經SNP6.0芯片掃描，在14例散發型PCC中均發現了CNV。其中，缺失的染色體包括1p(12/14)、3q(8/14)、17p(4/14)、22q(4/14)和11p(4/14)，擴增的包括22q(2/14)、17q(3/14)和9q(2/14)(表4，圖3)。CNV頻率最高的染色體為1p，其上的3段DNA片段chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471和chr1:98 902 091～107 622 430的缺失頻率均超過50%(表4，圖4)。另外4例遺傳型病例的SNP芯片掃描結果顯示， RET基因突變的3例均發生了1p中片段的缺失(表4)。

2.4 Q-PCR 結果

根據NCBI Genbank 及相關文獻，為上述3各片段對應的DNA序列分別設計3組引物(表5)。熔解曲線顯示Q-PCR產物均為單一擴增(圖5)。經Q-PCR驗證，chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471及 chr1:98 902 091～107 622 430這3個片段發生的頻率分別為28/38、27/38及23/38，均超過50%(表4)。

3 討論

目前通過比較基因組雜交技術(comparative genomic hybridization，CGH)發現發現散發型PCC中CNV很常見，拷貝數缺失是CNV最常見的表現形式[5]。拷貝數缺失常導致等位基因雜合性的缺失(LOH)，而LOH的區域往往是抑癌基因所在的位置[6]。這些研究結果高度提示在缺失的染色體片段中可能存在著散發型PCC的抑癌基因。但CGH只能得出CNV的位置，而無法確定是否存在LOH，因而無法確定相關基因的位置。而SNP芯片可以在確定CNV區域的同時驗證是否存在LOH[4]。本研究通過SNP6.0芯片共掃描的14例散發型PCC均發生了CNV。其中擴增的7例，而全部14例均出現了缺失，這表明拷貝數缺失是散發型PCC發病過程的重要事件，也提示抑癌基因的失活可能在散發型PCC的發病中發揮了重要的作用[7]。另外本研究發現缺失的染色體包括1p，3q，11p，13q，17p和22q，這與既往的研究結果類似[7- 8]。

表4 SNP芯片及Q-PCR結果

grey area.result of SNP chip；*inherited cases；×.finding the deletion；-.no foundong the deletion；blank.no data.

表5 以3段熱點區域設計的Q-PCR引物

region1.chr1.74 957 006-86 132 879；region2.chr1:58 096 424-67 700 471；region3.chr1:98 902 091-107 622 430.

Green lines on left side indicate loss of DNA copies situated in that area; Red lines on right side indicate gains of DNA copies situated in that area

圖3 散發型PCC中CNV的頻率

Fig 3 The frequency of CNV in sporadic PCC

Blue regions indicate deletion area圖4 SNP6.0芯片顯示的14例散發型PCC中1p上CNV的頻率Fig 4 The frequency of CNV of 1p in sporadic PCC

The single peak indicates single product圖5 Q-PCR產物的熔解曲線Fig 5 Melt curve of Q-PCR

目前認為1p是散發型PCC最常見的缺失片段[5]，1p的缺失與多種腫瘤相關,如少突膠質細胞腫瘤、神經母細胞瘤[9- 10]。本研究中最常見的缺失片段也是1p(12/14)，并且發現了其上3段最常見的缺失區域，結合Q-PCR的驗證結果，提示這3段區域存在散發型PCC的相關基因。

另有研究發現RET基因突變的遺傳型PCC中，1p的缺失比率高達80%～100%，而MEN2中PCC的外顯率卻僅有5%[11]，這提示除RET基因突變外，尚需其他DNA的異常事件才能最終導致PCC。本研究中4例RET突變的病例(3例遺傳型，1例散發型)均發生了1p片段的缺失，這提示RET突變的散發型和遺傳型PCC具有類似的發病機制，除了已知的RET基因突變外，還可能與1p部分區域的缺失相關。

本研究為初步實驗結果，通過深入研究散發型與遺傳型PCC以及良惡性PCC之間有表達差異的基因, 可以進一步探索PCC的分子病因學基礎,從而為PCC的早期診斷、良惡性鑒別以及治療提供新的途徑。

[1] Tsirlin A, Oo Y, Sharma R,etal. Pheochromocytoma: a review[J].Maturitas. 2014, 77:229- 238.

[2] Galan SR, Kann PH. Genetics and molecular pathogenesis of pheochromocytoma and paraganglioma[J].Clin Endocrinol, 2013, 78:165- 175.

[3] Lenders JW, Eisenhofer G, Mannelli M,etal[J].Phaeochromocytoma[J]. Lancet, 2005, 366:665- 675.

[4] Gruel N, Benhamo V, Bhalshankar J,etal. Polarity gene alterations in pure invasive micropapillary carcinomas of the breast[J].Breast Cancer Res,2014,16:R46. [Epub ahead of print]

[5] Dannenberg H, Speel EJ, Zhao J,etal. Losses of chromosomes 1p and 3q are early genetic events in the development of sporadic pheochromocytomas [J].Am J Pathol, 2000, 157:353- 359.

[6] Couto SS. The pathologist’s slide reveals more than meets the eye: loss of heterozygosity and cancer biology [J].Vet Pathol, 2011, 48:236- 244.

[7] Sandgren J, Diaz de St?hl T, Andersson R,etal. Recurrent genomic alterations in benign and malignant pheochromocytomas and paragangliomas revealed by whole-genome array comparative genomic hybridization analysis[J].Endocr Relat Cancer, 2010, 17:561- 579.

[8] Sun HY, Cui B, Su DW,etal. LOH on chromosome 11q, but not SDHD and Men1 mutations was frequently detectable in Chinese patients with pheochromocytoma and paraganglioma [J].Endocrine, 2006, 30:307- 312.

[9] 熊佶，劉 穎，李 超.少突膠質細胞瘤染色體 1p/19q 雜合性缺失與 P53 蛋白表達的相關性研究[J]. 中華病理學雜志, 2009：123- 125.

[10] Grundy PE, Breslow NE, Li S, Perlman E,etal. Loss of heterozygosity for chromosomes 1p and 16q is an adverse prognostic factor in favorable-histology Wilms tumor: a report from the National Wilms[J].J Clin Oncol, 2005, 23:7312- 7321.

[11] Gimenez-Roqueplo AP, Dahia PL, Robledo M. An update on the genetics of paraganglioma, pheochromocytoma, and associated hereditary syndromes[J].Horm Metab Res, 2012,44:328- 333.

Screen of the tumor-related regions of sporadic pheochromacytoma

WANG Dong, LI Han-zhong*

(Dept. of Urology, PUMC Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100730, China)

Objective To identify candidate regions of sporadic pheochromacytoma(PCC). Methods Totally 42 patients who were clinically diagnosed as sporadic PCC from 2011-9 to 2013-5 in PUMCH were enrolled. To extract whole genome DNA from their tumors as well as peripheral blood leukocytes and to exclude inherited cases by Sanger sequence mutation. Within 14 verified cases of sporadic PCC, we applyed single nucleotide polymorphism (SNP) chip to detect whole genome DNA copy number variations (CNV) and loss of heterozygosity (LOH) to initially locate the hot regions. Finally apply Q-PCR to confirm the hot regions in left cases. Results 38 cases were identified as sporadic PCC, and 4 as inherited cases. CNV were found in 14/14 tumors, of which deletions were more common. Missing regions occurred in 1p,3q,17p,22q,11p. On the other hand, of the 3 inherited cases, deletion was also detected. The loss of parts of arm 1p is the most common, including chr1:74 957 006～86 132 879, chr1:58 096 424～67 700 471, and chr1:98 902 091～107 622 430. The result of Q-PCR confirmed the above-mentioned three regions, and the three segments are final candidate regions. Conclusions Partially deletion of 1p in most cases is the most striking phenomenon, we believe that the deletion of 1p may occur with PCC development, and there may be some tumor suppressor gene(s) within these areas.

sporadic pheochromacytomas; single nucleotide polymorphism chip; genes

2014- 07- 03

2014- 10- 08

1001-6325(2015)01-079-07

R699.3

A

*通信作者(corresponding author)：jellowaaa7@163.com