7份杭白菊種質的耐鹽性評價

張朋　王康才　朱光明等

摘要： 以7份杭白菊為試材，采用人工海水作為篩選滲透壓，在測定一系列生長指標和水分生理指標的基礎上，通過主成分分析、模糊數學隸屬函數法、聚類分析和灰色關聯等方法，對杭白菊種質的耐鹽性進行綜合評價，篩選出合適的評價指標。結果表明：生物量、膜透性、SOD（超氧化物歧化酶）、可溶性總糖、POD（過氧化物酶）、游離脯氨酸等指標可作為杭白菊耐鹽性快速鑒定評價的指標；聚類分析法將7份杭白菊種質的耐鹽性分為強、中、弱3類，耐鹽性強的種質為單瓣4號，耐鹽性中的種質為NJK1、管花2號、NJK2、NJK3，耐鹽性弱的種質為大花4號和紅心2號；模糊數學隸屬函數法評價杭白菊種質耐鹽性由強到弱依次為單瓣4號>NJK1>NJK2>紅心2號>NJK3>管花2號>大花4號。主成分分析、隸屬函數法和聚類分析對7份杭白菊種質的耐鹽性評價結果相對較為一致，單瓣4號、NJK1、NJK2可作為杭白菊耐鹽育種的優良種質資源。

關鍵詞： 杭白菊；人工海水；主成分分析；綜合評價；耐鹽性；生長指標；生理指標

中圖分類號： S682 1+10 1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0234-05

收 稿日期：2014-08-20

菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat ）的干燥頭狀花序，是傳統常用中藥，具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒的功能。近年來，隨著國內外食品、醫藥和飲料加工業的迅猛發展，作為藥食兼用的菊花用量激增。江蘇省射陽縣東臨黃海，土地鹽堿程度參差不齊，可開發沿海灘涂面積巨大。濱海鹽土的最大特點是土壤和地下水鹽分組成與海水較為類似，模擬海水脅迫，探索海水對植物生長影響的機制，可為沿海灘涂鹽堿地種植農作物提供理論依據 [1]。

江蘇省射陽縣是我國杭白菊的主產區之一，篩選耐鹽能力較強的杭白菊種質對其育種和生產具有十分重要的意義。目前，已有許多學者開展菊耐鹽性及小麥等海水耐鹽篩選研究 [2-7]，但有關藥用杭白菊的耐鹽性評價研究鮮見報道 [8-9]，采用數學統計方法進行耐鹽性評價的就更少。為此，本試驗采用人工海水脅迫處理的方法，綜合運用主成分分析、模糊數學隸屬函數法、聚類分析和灰色關聯等對7份杭白菊種質材料的耐鹽性進行綜合評價，以期建立較為完善的人工海水脅迫條件下杭白菊耐鹽性鑒定方法與評價指標，為杭白菊的耐鹽性評價及耐鹽品種的選育提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1 1 材料

試驗于2013年3—6月在南京農業大學中藥材研究所實驗室進行，以NJK3、NJK2、大花4號、單瓣4號、管花2號、NJK1、紅心2號共7份優良杭白菊種質為試材。

1 2 方法

1 2 1 試驗設計 2013年3月下旬，選取7份種質無病蟲害、健壯枝條進行扦插；4月下旬，選取根系良好、生長一致的扦插幼苗定植于放有穴盤、規格為50 cm×34 cm×16 cm 的水培箱中，每個穴盤有140個小孔，幼苗采用“之”字形間隔種植，培養液為1/2 Hoagland營養液，pH值控制在5 5～7 0之間，用空氣壓縮泵給水培箱營養液間歇通入空氣，30 min/h； 預培養5 d，待植株恢復正常生長，以40%人工海水進行脅迫處理，以1/2 Hoagland營養液處理作為空白對照（CK），每處理重復3次。為避免鹽沖擊效應，初始采用濃度為10%的人工海水，后每天遞增15%逐漸提高人工海水濃度，于第3天達到設定濃度后即維持不變。每隔3 d更換1次營養液。

1 2 2 相關性狀及生理指標測定 試驗處理前后，分別采用電子數顯卡尺測定植株株高，采用分析天平稱量植株的鮮質量；處理后3周，隨機選取各杭白菊種質相同部位的葉片測定各個生理指標，可溶性總糖、可溶性蛋白、SOD（超氧化物歧化酶）活性、CAT（過氧化氫酶）活性、POD（過氧化物酶）活性、MDA（丙二醛）含量、游離脯氨酸（Pro）含量分別采用蒽酮比色法、Folin酚法、氮藍四唑（NBT）法、高錳酸鉀滴定法、愈創木酚法、硫代巴比妥酸（TBA）法、磺基水楊酸法測定，相對含水量、光合色素和超氧陰離子（ O-2[KG- 2]· ）采用高俊鳳等的方法 [10]測定，膜透性采用美國EXTECH EC400筆式電導率TDS鹽度計測定。

1 3 數據處理

采用Excel 2007和統計軟件SPSS 19 0進行數據標準化處理和主成分分析，利用隸屬函數法和主成分賦予權重法分別求出耐鹽性的綜合評價值，并進行耐鹽性排序；對7份杭白菊種質材料進行耐鹽性聚類分析，采用LSD法檢驗各處理的差異顯著性。

2 結果與分析

2 1 人工海水脅迫對杭白菊葉片抗氧化酶活性、超氧陰離子、MDA含量和膜透性的影響

由表1可見，40%人工海水脅迫下，7種杭白菊種質的SOD、POD和CAT活性及超氧陰離子、MDA含量和膜透性均出現不同程度的增加，且各供試材料的差異達到顯著水平；單瓣4號SOD活性增加最多，為對照的2 50倍，而NJK3的SOD活性僅為對照的0 83倍；單瓣4號CAT活性增加也最多，為對照的2 99倍，而管花2號增加最少，僅為對照的132倍；管花2號POD活性增加最多，為相應對照的2 08倍，而紅心2號僅為對照的1 15倍；大花4號超氧陰離子含量最高，為1 275 0 μg/g，單瓣4號相對最小，為513 8 μg/g；NJK1的MDA含量增加最為明顯，為對照的3 28倍，而單瓣4號增加幅度相對最小，為對照的1 78倍；大花4號的膜透性增加最多，為對照的2 22倍，而NJK3僅為對照的1 21倍。

2 2 人工海水脅迫對杭白菊葉片中光合色素含量的影響

由表2可見，40%人工海水脅迫下，各供試材料葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素含量與對照相比，總體均呈降低趨勢，且各材料間的差異達到顯著水平；管花2號的葉綠素a含量降低最多，較對照降低了51 81%，而NJK1降幅最小，較對照僅降低了10 84%；NJK2的葉綠素b含量降低最多，較對照降低了37 25%，而紅心2號降幅最小，較對照僅降低了12 20%；管花2號的類胡蘿素含量降低最多，較對照降低了61 54%，而NJK1、單瓣4號、NJK3的類胡蘿卜素含量卻較對照有不同程度增加；管花2號的總葉綠素含量降低最多，較對照降低了52 30%，紅心2號降幅最小，較對照僅降低了13 42%；人工海水脅迫下，NJK2、單瓣4號、NJK3、紅心2號的總葉綠素含量相對較高，分別為1 65、145、1 35、1 29 mg/g。

2 3 人工海水脅迫對杭白菊生長和滲透調節物質的影響

由表3可見，40%人工海水脅迫下，7種供試材料的生長量、生物量、相對含水量較對照均有不同程度的下降，可溶性總糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量較對照均有不同程度的上升，且各材料間的差異達到顯著水平；大花4號的生長量降低最多，較對照降低了72 73%，單瓣4號降低最少，較對照僅降低了38 46%；大花4號的生物量降低最多，較對照降低了7557%，紅心2號降低最少，較對照僅降低了39 39%；管花2號的相對含水量降低最多，較對照降低了27 98%，單瓣4號降低最少，較對照僅降低了12 63%；單瓣4號的可溶性總糖、可溶性蛋白增加最多，分別為對照的3 93、3 33倍，而管花2號僅分別為對照的1 12、1 20倍；管花2號的脯氨酸含量增加最多，為對照的34 81倍，而NJK2僅為對照的6 51倍；人工海水脅迫處理下，單瓣4號的可溶性總糖、NJK2的可溶性蛋白及管花2號的脯氨酸含量最高，分別為0 59 mg/g、0 14 mg/g、248 9 μg/g。

2 4 耐鹽性綜合評價

2 4 1 主成分分析 試驗測定的16個指標間部分存在顯著或極顯著差異，所提供的信息也發生重疊，直接利用這些指標對杭白菊幼苗進行耐鹽性評價會產生較大偏差。主成分分析法充分考慮了各指標之間的重疊信息，將原來個數較多且彼此相關的指標，轉換成新的個數較少且彼此獨立的綜合指標，可較為全面地對不同品種的抗逆性進行評價。對人工海水脅迫處理的7個杭白菊種質資源16個指標的耐鹽系數進行主成分分析，結果（表4）表明，有5個主成分的累計貢獻率達到92 932%，可以較充分地概括原有指標的信息，確定提取這5個主成分進行分析，把原有的16個單項指標轉化為5個相互獨立的綜合指標。

根據各綜合指標的貢獻率大小，可以知道各指標的相對重要性。根據16個指標在鹽脅迫下平均值的標準化值及各綜合指標的相關系數（表5），求出每一種杭白菊種質資源的5個綜合指標值（表6），根據主成分分析綜合得分公式，可以求[CM（25]得7種供試材料所對應的主成分綜合得分。由表7可見，單瓣4號、NJK1、NJK2耐鹽能力較強，而大花4號和NJK3對鹽脅迫較為敏感。

2 4 2 模糊數學隸屬函數評價 采用16個單指標評價7種供試材料的耐鹽性強弱時，評價結果存在較大差異。為更好地全面反映杭白菊不同材料真實的耐鹽能力，需對各項指標進行綜合考慮，而隸屬函數綜合評價法提供了可行性，避免了各測試指標間信息的重疊性。隸屬函數綜合評價以主成分分析提取的5個主成分綜合評價值為指標，計算每一材料各綜合指標的隸屬函數值，編號分別為D1、D2、D3、D4、D5，公式為：μ（xj）=（xj-xmin）/（xmax-xmin） [10]，式中，xj代表各材料所對應的每一個綜合評價值。根據綜合指標貢獻率的大小，計算各隸屬函數值對應的權重 [11]，公式為：Wj=Pj/ P，式中，Wj表示第j個綜合評價值在5個主成分的貢獻率之和。由表6可見，各隸屬函數值所對應的權重分別為0 262 4、0 261 4、0 177 1、0 170 9、0 128 2。從而進一步計算各材料的隸屬函數綜合評價值，公式為：D=∑（μj×Wj）。由表7可見，單瓣4號、NJK1、NJK2耐鹽能力較強，而大花4號和管花2號對鹽脅迫較為敏感。

2 4 3 聚類分析 聚類分析作為一種無管理模式的識別方法，試驗結果很大程度上取決于方法所采用的距離、類間距等參數 [12]。以主成分分析提取的5個主成分綜合評價值為指標，對數據進行標準化處理，以歐氏距離的平方為相似尺度，采用組間連接的方法進行系統聚類分析，將供試材料耐鹽性分為強、中、弱3類。由圖1可見，耐鹽性強的種質為單瓣4號，耐鹽性中的種質為NJK1、管花2號、NJK2、NJK3，耐鹽性弱的種質為大花4號和紅心2號。

2 4 4 灰色關聯分析 聚類分析、主成分分析和模糊數學隸屬函數法分別對杭白菊供試材料的耐鹽能力進行了分門別類和綜合評價排序，但對杭白菊耐鹽篩選的具體量化指標缺乏一個明確的定性，不能方便有效地用于杭白菊其他材料耐鹽能力的快速判斷，采用更為有效的方法對耐鹽指標進行明確和簡化很有必要。按照灰色系統理論， 將7種供試材料的耐鹽綜合評價值及16個指標視為一個整體，耐鹽綜合評價值為母序列，其他16個量化指標為子序列。利用SPSS 19 0對原始數值進行標準化處理，使其變成無量綱數值；利用關聯系數和關聯度求解公式，分別求得各子序列和母序列之間的關聯系數和關聯度并排序，結果表明，SOD、可溶性總糖、生物量、膜透性、POD、Pro、類胡蘿素、超氧陰離子、CAT、葉綠素b、MDA、生長量、葉綠素總量、可溶性蛋白、相對含水量、葉綠素a關聯度系數由高到低分別為0 99、0 77、0 76、0 73、0 69、0 69、0 68、0 67、0 64、0 63、0 60、0 60、0 59、0 57、0 57和0 56，SOD、可溶性總糖、生物量、膜透性、POD、Pro等指標與杭白菊耐鹽性評價有較好的關聯度。

3 結論與討論

鹽脅迫是全球普遍存在的一種非生物脅迫，是鹽堿地上限制植物生長和發育的主要環境因素。不同物種對鹽漬環境的適應能力和適應機制均會存在明顯的差異，同一物種的不同栽培類型的耐鹽性也會有所不同。何先元等研究發現，大白菊和長瓣菊耐鹽性較弱，紅心菊和小白菊耐鹽性較強；紅心菊和小白菊適于在鹽堿地種植 [8]。王康才等研究發現，在低濃度鹽脅迫下，紅心菊耐鹽性高于黃菊，而在高鹽脅迫下，黃菊耐鹽性高于紅心菊 [9]。本試驗結果表明，7份杭白菊種質在人工海水脅迫下，其耐鹽性有較大差別，總體表現為抗氧化酶、可溶性總糖、Pro等滲透調節物質及超氧陰離子、MDA、膜透性等指標均出現不同程度的增加，而光合色素含量、生長量、生物量及相對含水量等指標較對照存在不同程度的下降。當然也有例外，NJK1、單瓣4號、NJK3在遭受脅迫時，類胡蘿素含量與對照相比沒有降低，反而有不同程度的增加，這說明一定程度的脅迫作用會促進部分材料的某些生理進程，并表現出對鹽脅迫具有較強的適應性。基因決定表現型，杭白菊不同材料耐鹽性不同，也許還與杭白菊本身基因高度雜合、染色體數從43條到55條不等有關，這也說明了杭白菊的耐鹽能力不能僅憑借幾個簡單的指標就可以評價。

植物耐鹽性是由多因素相互作用而形成的一個十分復雜的生理生態響應過程，不同植物不同時期的耐鹽性都會所不同，任何單一指標的測定與研究都不可能有效、準確地評價植物的耐鹽性，而評價指標過多，不僅增加研究難度，也會造成資源的浪費。因此，找出那些起關鍵作用的指標，可以達到以較少指標準確評價植物耐鹽性的目的，而綜合利用形態生理和生化等指標，對植物的耐鹽性進行綜合評價是比較科學合理的。管志勇等運用主成分分析，提煉出葉片傷害率、葉綠素a含量、葉綠素總量、凈光合速率、丙二醛含量 5個關鍵篩選指標， 對大島野路菊等5種菊花的耐鹽性進行了綜合評價 [3]；李豐先等通過模糊數學隸屬函數法和主成分分析法，對各高粱品種進行耐堿性綜合評定，篩選出根長、發芽指數、葉干重等指標用于大量高粱品種萌發期耐堿性的篩選，并對結果進行聚類分析，對高粱品種進行了耐堿性分類 [13]；楊升等利用相關分析、主成分分析和隸屬函數法，對3個樹種的耐鹽性進行綜合評價，并通過灰色關聯分析，最終篩選出株高、相對生長量、膜透性、脯氨酸、根莖葉中的Na+和K+含量等作為耐鹽性評價的重要指標 [14]。本研究結合前人的研究成果，采用主成分分析、模糊數學隸屬函數法、聚類分析、灰色關聯分析方法，利用16個指標對7份杭白菊種質材料的耐鹽性進行綜合評價，結果發現，主成分分析和模糊數學隸屬函數法對NJK2、大花4號、單瓣4號、NJK1、紅心2號的耐鹽性評價較為一致，僅對NJK3和管花2號的評價稍有不同；將系統聚類分析與主成分分析、模糊數學隸屬函數法得分排序的結果對比發現，除紅心2號和NJK3外，其他供試材料3種評價方法結果較為一致，尤其鹽能力較強杭白菊種質單瓣4號和對鹽脅迫較為敏感的種質大花4號，3種評價方法的結果完全一致。聚類分析法與主成分分析、模糊數學隸屬函數法之所以存在耐鹽性評價差異，這是由于聚類分析法是一種等權重的綜合評價方法，而實際上不同指標在評價耐鹽性上的權重是不相同的。

灰色關聯分析結果顯示，SOD、可溶性總糖、生物量、膜透性、POD、Pro等指標與杭白菊耐鹽性評價有較大的關聯度，這些指標可反映植物在鹽脅迫環境下的生長情況、膜系統穩定性、滲透調節能力和抗氧化酶膜透性的大小，相應反映了植物葉片的受損程度，膜透性越大，葉片受損越嚴重，必然導致葉綠素含量降低。Mohamed等認為，膜透性可以作為植物耐鹽能力評價的一個重要指標，而脯氨酸是植物在逆境環境條件下的一種重要滲透調節物質，在植物體內不僅作為滲透調節劑調節滲透壓，還起著改善植物微環境、保證其他生化反應正常進行的作用 [15]。Wided等研究發現，鹽脅迫下葉片中的脯氨酸會顯著積累，這可以作為一個耐鹽的評價指標 [16]；可溶性糖是很多非鹽生植物的主要滲透調節劑 [17-18]，它也是合成其他有機溶質的碳架和能量來源 [19]，對細胞膜和原生質膠體有穩定作用，還可在細胞內無機離子濃度高時起保護酶類的作用；SOD、POD是膜系統的抗氧化酶，可以減輕膜系統的氧化損傷；脯氨酸、可溶性糖、MDA含量、SOD、POD活性可以作為鑒定番茄幼苗耐鹽性的生理指標 [7]。本試驗將灰色關聯分析通過與主成分分析中因子載荷矩陣進行對比發現，可溶性總糖、POD、Pro與主成分高度相關，因子載荷矩陣雖然不能直接反映相關指標對耐鹽性的影響，但卻可以通過影響主成分并最終對杭白菊耐鹽性產生重大影響。因此，利用SOD、可溶性總糖、生物量、膜透性、POD、Pro這6個指標對杭白菊耐鹽性的快速評價較為合適。同時，綜合評價認為，杭白菊種質單瓣4號、NJK1、NJK2耐鹽能力較強，可以作為杭白菊耐鹽育種的優良種質資源。

需說明的是，本研究是在模擬海水的鹽分條件下在室內所做的水培試驗，與實際濱海鹽堿地條件還有一定差別，自然條件下鹽堿地植物會受各種因素的影響，各種逆境條件相互作用、相互影響，植物在不同時期、不同環境下對鹽脅迫的反應會不盡相同；因此，大田試驗和不同生育期對比試驗將是下一步的研究方向。

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