外周血NF-κB活性及血清GSH水平與2型糖尿病周圍神經病變的關系分析

楊青青　李全民★　王　爽　杜瑞琴　顏　艷　胡曉強

外周血NF-κB活性及血清GSH水平與2型糖尿病周圍神經病變的關系分析

楊青青李全民★王爽杜瑞琴顏艷胡曉強

目的 探討糖尿病周圍神經病變（DPN）與外周血核轉錄因子（NF-κB）活性及血清還原型谷胱甘肽（GSH）水平之間的關系，分析其在不同程度糖尿病周圍神經病變中的變化及意義。 方法 85例2型糖尿病（T2DM）患者，分為不存在DPN、輕度、中度、重度DPN4組，健康對照組（N組）38名。測定其血清GSH水平及外周血NF-κB活性，進行統計學分析。結果 T2DM組較N組血清GSH水平下降、NF-κB活性升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。五組間兩兩比較顯示各組間血清GSH水平及NF-κB活性比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。 結論 T2DM合并周圍神經病變組血清GSH水平較單純T2DM組下降、NF-κB活性升高，隨著周圍神經病變的加重，GSH水平顯著下降、NF-κB活性明顯升高。

2型糖尿病 周圍神經病變 還原型谷胱甘肽 核轉錄因子

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病神經病變中較常見的一種，發生多隱匿、漸進，可導致足部潰瘍、壞疽和截肢等嚴重的后果，其早期診斷及治療一直是研究的重點。還原型谷胱甘肽（GSH）是細胞內重要的抗氧化物，其可以清除自由基，降低細胞內氧化應激的活性。GSH的減少會加重體內氧化應激的狀態。核轉錄因子（NF-κB）是炎癥途徑的重點，慢性NF-κB的活化可使神經元和血管對缺血再灌注損傷更敏感，從而參與糖尿病神經病變的進展。本實驗通過檢測不同程度糖尿病周圍神經病變患者的外周血NF-κB活性及血清GSH的水平，探討其與2型糖尿病（T2DM）及不同程度周圍神經病變的關系。

1　臨床資料

1.1一般資料 篩選2012年2月至10月中國人民解放軍第二炮兵總醫院內分泌科收治的105例T2DM患者，根據多倫多臨床評分系統（TCSS）［1］進行 DPN的診斷及嚴重程度的分級后，納入85例T2DM患者，分為4組：（1）A組（單純T2DM）：不存在DPN組（0～5分），20例；（2）B組：輕度DPN（6～8分），22例；（3）C組：中度DPN（9～11分），22例；（4）D組：重度DPN（12～19分），21例。健康對照組38例，為同期體檢健康人群。T2DM的診斷符合1999年世界衛生組織（WHO）T2DM診斷標準，排除有發熱、尿頻、尿急、尿痛癥狀和或尿菌、白細胞陽性等急、慢性尿路感染，腎結石、腎小球腎炎及間質性腎炎等泌尿系疾病，嚴重心、腦疾病，急慢性感染性疾病及惡性腫瘤，此外尿微量白蛋白定量（≥200 mg/L）的患者亦排除在外。1個月內患有糖尿病急性并發癥（如酮癥酸中毒、高滲性昏迷等）。嗜酒、吸煙及在過去5年內有吸毒或其他精神性藥物濫用史者。

1.2方法 糖尿病病程從明確診斷至納入研究為止，以“年”為單位。收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）取不同日清晨靜息狀態二次血壓的平均值。脫鞋去帽測站立位身高及體重，計算BMI計算體質量指數［BMI=體重（kg）/身高2（m2）。所有觀察對象均晚餐后空腹＞8h，次日晨起采集肘靜脈血及尿液，送入生化室檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）、血膽固醇（TC）、血甘油三酯（TG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），HbA1c采用高壓液相法測定，余生化指標采用全自動生化分析儀測定。另收集血清凍存在-70℃冰箱，用于檢測GSH及NF-κB。血清GSH水平的測定使用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定，外周血單個核細胞NF-κB活性的測定方法如下：所有受試對象于當天采用 EDTA 抗凝管抽取空腹靜脈血10ml。在50ml管中加入20ml人淋巴細胞分離液，取EDTA抗凝靜脈血10ml，與等量的Hanks液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢注入到分層液面，注意保持清晰的分離界面。水平離心2000rpm，20min，離心后管內分3層，上層為血漿和Hanks液，中間層為淋巴細胞分離液，下層為紅細胞和粒細胞，此外還有血小板。介于上層和中間層界面處還有一個以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶。用吸管插入到云霧層，吸取單個核細胞。另取15ml試管1支，加入Hanks液10ml，將吸取的單個核細胞置入，1500rpm，離心10min，加入重復1次，末次離心后小心吸出上清液棄去，加入含有20%胎牛血清的RPMI 1640，重懸細胞，后提取核蛋白，凍存在-70℃冰箱內保存，采用雙抗體一步夾心法ELISA進一步測定外周血單個核細胞NF-κB活性，其板內及板間變異系數均＜15%。

1.3糖尿病周圍神經病變檢查及嚴重程度分級 在安靜的環境中由同一內分泌科專業醫生進行檢查，房間溫度控制在30℃左右，安靜且放松；檢查開始前，患者在房間內無寒冷的感覺；檢查時避開胼胝或潰瘍處；盡量使患者說出其最真實的感覺。所有患者均在知情同意、清醒、安靜狀態下進行TCSS檢查，采用自行設計的調查表同期收集患者TCSS評分，記錄TCSS神經病變分級，TCSS評分包括神經癥狀評分、神經反射評分及感覺功能檢查評分3部分。神經癥狀包括下肢的麻木、疼痛、針刺樣感覺、乏力及走路不穩及上肢相似癥狀，如正常計0分，存在相應癥狀計1分，共6分；神經反射包括踝反射及膝反射，為雙側計分，正常計0分，減弱計1分，消失計2分，共8分； 感覺功能檢查包括右側拇趾的痛覺、溫度覺、觸壓覺、振動覺、位置覺5項，正常0分，異常1分，共5分，總分19分。按照Perkins 等的分級標準，0～5分者不存在DPN，6～8分者為輕度DPN，9～11分者為中度DPN，12～19分者為重度DPN。

1.4統計學方法 采用SPSS14.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般資料 與健康對照組比較，T2DM組（A、B、C、D組）年齡、BMI、TC、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）差異無統計學意義（P＞0.05），SBP、DBP、TG、BUN差異有統計學意義（P＜0.05）。T2DM各組年齡、BMI、血脂、血壓、HbA1c、糖尿病病程比較差異均無統計學意義（P＞0.05）（見表1）。

2.2血清GSH及NF-κB活性在正常對照、T2DM及周圍神經病各組的測定結果及比較 T2DM組較正常對照組血清GSH水平下降、NF-κB活性升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。隨著周圍神經病變的加重，血清GSH的水平下降、NF-κB活性漸升高，T2DM五組間兩兩比較顯示各組間血清GSH水平及NF-κB活性比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　單純2型糖尿病組與糖尿病周圍神經病變亞組一般情況和生化指標比較（x±s）

2.3相關性分析 血清GSH與病程（r=-0.319，P＜0.01）、NF-κB（r=-0.776，P＜0.01）呈負相關；與年齡、HbA1c、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C、BUN、Cr等均不相關。NF-κB與病程（r=0.261，P＜0.01）、Scr（r=0.201，P＜0.05）呈正相關，與年齡、HbA1c、BMI、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C、BUN等均不相關。logistic回歸分析顯示DPN與NF-κB呈正相關（P＜0.05）。

3　討論

人們一直在尋找與DPN相關的血清標記物，為深入探討DPN的發病機制及防治提供線索。NF-κB是Sen等［2］在分析B淋巴細胞核抽提物時最先發現的一種能與免疫球蛋白κ 鏈基因的增強子κB序列（GGGACTTTCC）發生特異性結合的核蛋白因子，因此將它命名為NF-κB。正常狀態下NF-κB在胞漿內以非活化的形式存在，而胞核內微量的NF-κB主要起到維持正常生理功能的作用。高血糖狀態下，糖代謝異常產生較多NF-κB的活化刺激因子，如IL-1、TNF-α等，且蛋白激酶C（PKC）的活化［3］、Ang-Ⅱ濃度的增加［4］等，均可引起p65的移位，活化NF-κB，且隨著血糖水平的增高，對NF-κB激活作用逐漸增強，Kennefick等［5］在體外實驗中將血管內皮細胞置入在不同濃度的高糖環境下，檢測出NF-κB的活性隨高糖的濃度增加而升高。活化的NF-κB除刺激炎癥因子的釋放和表達增加外，且能夠產生放大效應。本資料結果提示隨著糖尿病病程的延長，NF-κB的活化與表達成遞增趨勢，這可能與病程及高血糖狀態持續時間的延長，進而導致更多炎癥因子的釋放、更多通路的開放相關。人體內氧化系統與抗氧化系統處于動態平衡中，但臨床研究和基礎實驗均證實高血糖可使活性氧自由基（ROS）生成增多，導致氧化系統與抗氧化系統失衡。而NF-κB可能在ROS敏感信號途徑的調節過程中起著關鍵作用［6］，是ROS、炎性因子信號調節途徑的重要調節因子。

此外，NF-κB亦是炎癥途徑的重點，慢性NF-κB的活化可使神經元和血管對缺血再灌注損傷更敏感，從而參與糖尿病神經病變的進展。NF-κB可刺激內皮細胞、施旺細胞及神經元等釋放細胞因子，引起巨噬細胞滲入增強，巨噬細胞增多又可進一步產生細胞因子，導致細胞氧化性損傷，影響神經元的再生。亦有研究證明，在糖尿病動物模型的脈管系統和周圍神經中存在NF-κB/環氧化酶-2向上調節［7］。但NF-κB的活化可能是具有細胞特異性的，其在不同的細胞，在不同的誘導物作用下，所開啟調控基因的表達是不一致的。鑒于其在促炎性基因表達和免疫功能調節中的重要作用，因此必須針對性地加以處理。同時NF-κB與其他轉錄因子之間的相互作用復雜，所以對于某一特定生理或者病理過程的意義也可能是不一致的。因此其在糖尿病周圍神經病變中的作用和意義均有待于進一步的研究。

本資料結果提示T2DM患者與合并周圍神經病變組患者血清GSH水平均下降，且隨著周圍神經病變的加重，GSH水平顯著下降，血清GSH水平與病程、NF-κB活性呈負相關。GSH參與體內氧化還原過程，能和過氧化物及自由基結合，對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基酶不被破壞，同時還可對抗自由基對重要臟器的損害。另有研究證實高血糖可使組織谷胱甘肽代謝異常，導致谷胱甘肽的依賴性H2O2降解機制受損害，從而使神經組織易受損傷［8］。

其他體外實驗亦證實多元醇途徑還可通過醛糖還原酶（AR）的過度表達，引起GSH的耗竭，激活NF-κB的表達，導致施旺細胞產生神經生長因子減少，致神經組織修復障礙［9］。多元醇代謝途徑是一條經典的高血糖損傷途徑，AR是該途徑的關鍵酶，在神經組織的施旺細胞內含量最高，患者體內的高糖環境可引起AR活化，其活力的增高造成山梨醇等代謝產物的蓄積后，可改變細胞的滲透壓、增加氧化應激反應，激活凋亡信號傳導通路，誘導細胞凋亡。但AR的活化需要消耗輔助因子NADpH，而NADpH是細胞內生成GSH的協同因子。Song ZT等［10］研究發現轉基因小鼠較非轉基因小鼠坐骨神經中AR的活性增高、運動神經傳導速度（MNCV）減慢、GSH含量下降。且有研究提示GSH治療糖尿病周圍神經病變，可顯著提高DPN患者神經傳導速度，其機制可能與其降低血漿ET-1水平有關［11］。另有研究顯示TGFβ1可能與糖尿病周圍神經病變相關［12］，且有研究顯示TGFβ1升高可致核因子kappa B（即NF-κB）的激活［13］，并影響GSH的產生和維持［14］，進而參與糖尿病周圍神經病變的發生、發展。

總之，外周血NF-κB的活性和血清GSH水平可能與糖尿病周圍神經病變的發生、發展有關，對糖尿病周圍神經病變的發病機制及防治有一定的參考價值。對于T2DM患者，不僅要使其血糖控制達標，抑制NF-κB的活性和升高血清GSH水平亦可能對糖尿病周圍神經病變的發生及進展有益，但仍需進一步的研究證實二者與糖尿病周圍神經病變的相關性。

1 劉鳳，毛季萍，顏湘，等. 多倫多臨床評分系統在糖尿病周圍神經病變中的應用價值. 中南大學學報：醫學版，2008，33（12）： 1137～1141.

2 Sen R， Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer senquences .Cell， 1986， 46（5）：705～716.

3 范秋靈，王力寧，周華，等.糖尿病腎病發病過程中腎小球蛋白激酶C活性變化的研究.中華腎臟病雜志，2000，16（5）：333～335.

4 Hey DJ，Singh AK，Alavin， et al. Role of angiotension II in DN.Kidney Int，2000， 58：S98～S98.

5 Kennefick TM， Oyamma TT， Thompson MM， et al .Enhanced sensitivity to angioternsin actions in distetes mellitus in rats. Am J Physiol， 1996，271：595～601.

6 Senffleben U，Karin M.The IKK/NF-kB pathway.Crit Care Med，2002，30（1 Supp1）：18～26.

7 Kellogg A P，Pop-Busui R.Peripheral nerve dysfunction in experimental diabetes is mediated by cyclooxygenase-2 and oxidative stress.Antioxid Redox Signal，2005，7（11～12）：1521～1529.

8 Kashiwagi A， Asahina T， Ikebuchi M， et al.Abnomal glutathione metabolism and increased cytotoxicity caused by H2O2in human umbilical vein endothelial cells cultured in high glucose medium. Diabetologia， 1994，37（3）： 264～269.

9 Takeshi Suzuki，Hiromi Sekido，Noriaki Kato，et al.Neurotrophin-3-induced production of nerve growth factor is suppressed in Schwann cells exposed to high glucose：involvementof the polyol pathway.Neuroc hemistry，2004，91（6）：l430～1438.

10 Song ZT，Fu DT，Chan YS，et al.Transgenic mice overex-pressing aldose reductase in Schwann cells show more severe nerve conduction velocity deficit and oxidative stress under hyperglycemic stress.Mol Cell Neurosci，2003，23（4）：638～647.

11 王煥君，管曉玲，李曙遠，等.還原型谷胱甘肽對糖尿病周圍神經病變患者神經傳導速度的影響.山東醫藥，2011，51（29）：57～58.

12 Ybarra J， Pou JM， Romeo JH，et al. Transforming growth factor beta 1 as a biomarker of diabetic peripheral neuropathy： cross-sectional study. Diabetes Complications，2010，24（5）： 306～312.

13 Cameron N. E.， Cotter， M.A. Pro-inflammatory mechanisms in diabetic neuropathy： Focus on the nuclear factor kappa B pathway. Current Drug Targets，2008，9（1）：60～67.

14 Roberts， R. A.， Michel C.， et al. Regulation of apoptosis by peroxisome proliferators. Toxicology Letters， 2004，149（1～3）：37～41.

Objective The aim of this study is to investigate the interrelationships between peripheral blood NF-kappa B activity，serum level of reduced glutathione（GSH）and type 2 diabetic peripheral neuropathy. In varying degrees of diabetic peripheral neuropathy，analyzing their changes and the signifi cance. Methods 85 patients with type 2 diabetes are divided into four groups：without DPN Group，with DPN of mild degree，with DPN of moderate degree，with severe degree of DPN. Normal control（N group）has 38 people.And all subjects determined the serum GSH level and peripheral blood NF-kappa B activity.Analyze the data observed in the study. Results There were signifi cant difference between DM group and N group in GSH and NF-κB（P＜0.01）. With the degree of peripheral neuropathy aggravated，the serum levels of GSH decreased，and the activity of NF-κB increased .There were signifi cant differences among the fi ve group in GSH and NF-κB（P＜0.05）. Conclusions Patients with type 2 diabetes mellitus had higher NF-κB activity and lower serum GSH level，with the degree of peripheral neuropathy aggravated，the serum levels of GSH decreased，the activity of NF-κB increased.

Diabetes mellitus，type 2 Diabetic peripheral neuropathy Reduced glutathione NF-κB

233000蚌埠醫學院第一附屬醫院（楊青青 王爽 杜瑞琴 顏艷 胡曉強）100088中國人民解放軍第二炮兵總醫院（李全民）