應用不同細胞濃度觀察裸鼠乳腺癌骨轉移的造模成功率

姚勇偉　朱飛葉　劉云霞　匡唐洪

·基礎研究·

應用不同細胞濃度觀察裸鼠乳腺癌骨轉移的造模成功率

姚勇偉朱飛葉劉云霞匡唐洪

目的 觀察不同細胞濃度進行裸鼠乳腺癌骨轉移造模的成功率。方法 30只裸鼠隨機分為3組，分別予以濃度為1×106/ml﹑5×106/ml﹑1×107/ml的細胞懸液0.1ml進行左心室注射，然后觀察其死亡情況，42d進行骨ECT掃描及病理檢查，確定其骨轉移發生情況。結果 骨ECT檢查顯示骨代謝有異常濃聚，病理檢查提示有腫瘤細胞浸潤，1×106組無裸鼠死亡，造模成功率為0%，5×106組有1只裸鼠死亡，造模成功率30%，1×107組1只裸鼠死亡，造模成功率70%（P＜0.01）。結論 裸鼠經左心室注射能有效建立乳腺癌骨轉移模型，采用1×107/ ml的細胞濃度是進行裸鼠左心室注射建立乳腺癌骨轉移模型較為合適的濃度。

細胞濃度 裸鼠 左心室 乳腺癌 骨轉移

乳腺癌是全世界婦女中最常見、最多發的腫瘤。我國乳腺癌占女性惡性腫瘤發病率的第一位［1，2］，而骨骼是乳腺癌最常見的轉移部位［3］。目前研究預防乳腺癌骨轉移的機制成為熱點，而乳腺癌骨轉移模型的建立則是研究的一個基本方法。左心室注射法是研究乳腺癌骨轉移機制的一個重要造模方法，2011年10月至2012年3月作者采用不同濃度的MD-231-MB乳腺癌細胞株，左心室注射法進行造模，觀察不同濃度造模的成功率，探索造模的最佳細胞濃度，為進一步研究乳腺癌骨轉移的機制和藥物治療研究提供實驗基礎。

1　材料和方法

1.1材料 （1）細胞株：人乳腺癌細胞株MDAMB-231，購自中國科學院上海細胞生物研究所。（2）動物：SPF級Balb/c 裸鼠，雌性，體重18～20g，30只，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供并飼養。（3）試劑：DMEM培養液（Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；水合氯醛、0.3%戊巴比妥鈉注射液、放射性核素骨顯像劑99mTc-MDP（由浙江大學附屬第二醫院核醫學科提供）；PBS液、各濃度乙醇。（4）儀器：顯微鏡（OLYMPUS IX70）；CO2恒溫培養箱（Thermo Fisher Scientific company）；超凈工作臺（蘇州宏瑞凈化科技有限公司）；超低溫冰箱（SANYO公司）；SINMENS MULTI-SPECT和GZ-B大視野伽碼相機（浙江大學附屬第二醫院核醫學科提供）。

1.2方法 （1）細胞制備：人乳腺癌細胞株MDAMB-231置于含10%小牛血清的DMEM培養液（含100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）中，于37℃、5% CO2培養箱中培養。根據細胞情況用0.25%胰蛋白酶消化，換液、傳代。貼壁細胞吹打成單細胞懸液，1500r/min離心6min，PBS調整細胞懸液濃度為1×106/ml、5×106/ml、1×107/ml，留存備用。（2）動物飼養：裸鼠飼養在浙江中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房中，按常規予以喂養。（3）造模：將3組裸鼠分別用SUMMIT小動物呼吸麻醉機，以3%異氟烷誘導麻醉，再用面罩以1.5%異氟烷維持麻醉。待麻醉后，裸鼠呈仰臥位，以75%酒精局部消毒，應用1ml注射器將腫瘤細胞注射入裸鼠左心室。各組裸鼠分別予以濃度為1×106/ml、5×106/ml、1×107/ml的細胞懸液注射，每只裸鼠接種量為0.1ml。進針角度與裸鼠腹面正中線呈45°角，與皮膚呈30°角，進針深度為0.8cm，回抽見到血液回流時，表明針尖已到達左心室，此時緩慢推注腫瘤細胞懸液。注射完畢后對裸鼠皮膚進行消毒，放回籠中，燈暖至蘇醒。觀察其術后精神及活動情況。

1.3指標觀察 注射后繼續飼養，自由進食，觀察裸鼠生活狀態及一般情況等；尤其在注射后＜48h應密切觀察裸鼠的生命體征和狀態。造模6周后，裸鼠行核素骨掃描。每只裸鼠尾靜脈注射Tc-MDP74MBq，體積≤0.1ml。注射骨顯像劑5～6 h后麻醉裸鼠，分別在SINMENS MULTI-SPECT和GZ-B大視野伽碼相機上行平面顯像和改良型針孔顯像。矩陣：256×256，Zoom：2.67，采集計數：200～300K/幀，采集體位：前后位、后前位、左側位和右側位。當發現裸鼠放射性分布異常的骨組織時做好記錄。解剖裸鼠，檢測其骨轉移的部位及數量，并取骨轉移灶，置于10%中性甲醛溶液，脫鈣，常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色觀察。

2　結果

2.1各組裸鼠骨轉移情況 3組造模成功率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1　各組裸鼠骨轉移情況比較（n）

2.2ECT檢查結果比較 無骨轉移裸鼠骨代謝未見有明顯濃聚；骨轉移裸鼠腰椎部位骨代謝有異常濃聚。

2.3病理檢查 無骨轉移裸鼠的骨組織病理檢查未見明顯的腫瘤細胞（圖1A）。骨轉移的病理檢查可見細胞密度明顯增高，核大深染，異型性明顯，（圖1B）。

圖1　裸鼠骨組織病理檢查比較

3　討論

目前，研究乳腺癌骨轉移的機制，開發預防或治療骨轉移的藥物是當前研究中的熱點。而乳腺癌骨轉移動物模型的建立是研究乳腺癌骨轉移機制的重要方法。本資料中乳腺癌細胞選用人乳腺癌細胞株MDAMB-231，為雌激素受體陰性ER（-）細胞株。而有轉移能力的多為ER（-）細胞株，如MDA-MB-231和MDA-MB-435細胞株等，其較易發生局部浸潤以及骨、肺等遠處轉移。目前左心室注射造模國外已有應用［4～6］，而國內左心室注射造模應用相對較少。但國內研究證實，左心室注射法骨轉移率較高［7］，這與國外文獻上報道的［8］30%～90%的骨轉移率相符。Arguello等［9］首先報道采用這種方法制作裸鼠骨轉移模型，其后經過多方改進，在裸小鼠上獲得成功。以往的相關研究中，不同作者采用經裸鼠左心室注射腫瘤細胞懸液致骨轉移的發生率有較大的差異［10～12］，此差異可能與注射的腫瘤細胞數量有關。本資料采用左心室注射法進行乳腺癌骨轉移造模，采用1×106、5×106、1×107/ml三個不同濃度的細胞懸液來進行注射造模。而在預實驗過程中，采用了5×107個/ml的細胞濃度，在注射3只裸鼠后均出現了死亡，根據預實驗結果，參考張帆［13］等乳腺癌模型構建方法，作者認為：細胞濃度越高，越容易造成裸鼠的死亡，這與左心室注射后可能出現因細胞濃度過高，細胞成塊，出現栓塞而導致死亡有關。但同時，細胞濃度越低，則其發生骨轉移的幾率越低，1×106/ml 細胞濃度組中，無一只裸鼠出現骨轉移，提示該組細胞懸液進入體內后，由于細胞數量太少，不能造成骨轉移，1×107/ml的細胞濃度是較為合適的，成瘤率為70%，相對成瘤率較高，裸鼠死亡率也在可控范圍之內，造模方法較為安全，值得推廣。

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Objective To observe the success rate of establishing the nude mice's breast cancer bone metastasis model by using different cells' concentrations. Methods Thirty female nude mice were divided equally into 3 groups，then injected with MDA-MB-231 cells suspended in 0.1ml PBS at the concentrations of 1×106（group1）﹑5×106（group2）﹑1×107個/ml（group3）into the left ventricles. Deaths following the injection were recorded，and the mice that survived 42 days after the injection were subjected to the ECT scan and pathological examination to determine bone metastasis. Results ECT scan displayed that bone metabolizing had exceedingly accumulated and pathological examination displayed that there were tumor cells in the bone tissues in some mice. No one mice died and the success rate was 0% in the group1. Only one rice died with 30% success rate in the group2 and in the group3，there was only one mice died，the success rate was 70%，P＜0.01. Conclusions We can establish the nude mice's breast cancer bone metastasis model by injecting the MDA-MB-231 cells into left heart ventricles. And found that the suitable concentration was 1×107個/ml cells suspended in 0.1ml PBS.

Cells' concentrations Nude rice The left ventricles Breast cancer Bone metastasis

浙江省中醫藥科學研究基金項目（2011ZA079）

310009 杭州市第三人民醫院（姚勇偉 劉云霞 匡唐洪）310005浙江中醫藥大學基礎醫學院（朱飛葉）