人骨髓和臍帶來源間充質干細胞體外分離培養及生物學特性比較

劉慧文

人骨髓和臍帶來源間充質干細胞體外分離培養及生物學特性比較

劉慧文

目的 對人骨髓和臍帶來源的間充質干細胞（MSC）體外分離培養，P3代細胞表面標志物及分泌細胞因子白細胞介素6（IL-6）的濃度進行比較。方法 流式細胞術檢測免疫表型，Miliplex試劑盒檢測IL-6的濃度。結果 兩種細胞P3代均高表達CD90﹑CD105﹑CD44﹑CD73及HLA-ABC抗原，均不表達CD14﹑CD34﹑CD45等造血細胞相關抗原，UC-MSC不表達HLA-DR抗原，BM-MSC低表達HLA-DR抗原。骨髓間充質干細胞不同時間點分泌的IL-6濃度均高于臍帶間充質干細胞，兩者均逐步升高。結論 臍帶間充質有更低的免疫原性，骨髓間充質干細胞在免疫調控方面更有優勢。

骨髓間充質干細胞 臍帶間充質干細胞 細胞免疫表型 白細胞介素6

間充質干細胞（MSC）是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，主要存在于骨髓基質中。由于其易提取擴增及低免疫原性，現已經廣泛應用于臨床細胞治療［1，2］。較多研究比較分析不同來源的MSC的生物學特征來選擇更適宜臨床應用的間充質干細胞種類［3，4］。2014年2月至2015年1月作者選擇人骨髓和臍帶兩種來源的MSC，比較其免疫表型及分泌細胞因子的差異，為臨床應用提供參考。

1　臨床資料

1.1骨髓間充質干細胞（BM-MSC）的分離與培養 健康供者的骨髓（n=21）于無菌肝素抗凝管內離心棄上清液，用PBS重懸后與Ficoll分離液（挪威Axis-Shield）以5：3比例加入50ml離心管，1900r/ min，離心15min，吸取中間白膜層，用PBS洗滌2次后用10%FBS（加拿大Stemcell）、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的αMEM（美國Gibco）完全培養基重懸細胞，以3×105/cm2的密度接種于T75cm2細胞培養瓶（美國Corning），置于2.5%CO2的37℃培養箱中，2d后換液，之后換液2次/周至細胞匯聚度達80%～90%，吸棄培養液，每瓶加2.5ml0.25%胰酶EDTA鈉溶液（美國Gibco），于培養箱消化8min后吸出所有液體加入等量的αMEM完全培養基中和，1200r/min］離心后獲得P0代細胞，以細胞密度4×103/cm2傳代擴增至P3代時進行免疫表型分析及細胞因子檢測。

1.2臍帶間充質干細胞（UC-MSC）的分離與培養 取來自足月剖宮產健康產婦的臍帶（n=18）10cm左右置于含100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的PBS中浸泡，用PBS反復洗滌后剪成1cm左右長短的小塊，再用PBS洗滌2遍，加入3倍體積的含0.2%Ⅳ型膠原酶（美國Worthington）的αMEM培養基，于37℃水平振蕩器250r/min消化2h，后用αMEM培養基洗滌3遍去除膠原及膠原酶，用上述完全培養基重懸于2～4個T75cm2細胞培養瓶，后如上述消化傳代至P3代進行免疫表型及細胞因子檢測。

1.3BM-MSC及UC-MSC表面標志物的檢測 取P3代的兩種間充質干細胞制成單細胞懸液，分別加入鼠抗人PE標記的CD34、CD90、CD105、CD14、HLAABC及FITC標記的CD44、CD45、CD73、HLA-DR單克隆抗體（美國BD Pharmingen），常溫避光孵育30min，后用PBS洗滌2遍，重懸于500μl PBS中用流式細胞儀檢測。

1.4BM-MSC及UC-MSC分泌白細胞介素6（IL-6）的檢測 分別收集兩種MSC P3代培養前含10%FBS的αMEM完全培養基，以及細胞開始貼壁后第2、5、8、11、15、16、17天吸取培養瓶內的1ml上清液共8份標本作為檢測對象于-20℃保存（11d后為細胞匯聚度≥90%時）。將收集的原始培養基及上清液PBS稀釋100倍后用Miliplex試劑盒檢測。

2　結果

2.1兩種間充質干細胞免疫表型 兩種間充質干細胞P3代表型特征相似，均高表達CD90、CD105、CD44、CD73及HLA-ABC抗原，均不表達CD14、CD34、CD45等造血細胞相關抗原，UC-MSC不表達HLA-DR抗原，BM-MSC低表達HLA-DR抗原，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.05）見表1。

表1　BM-MSC與UC-MSC表面抗原比較（x±s）

2.2兩種間充質干細胞不同時間點分泌IL-6濃度 BM-MSC P3代在實驗選取的各時間點分泌IL-6的量均高于UC-MSC的P3代（P＜0.05），且兩種間充質干細胞P3代均在細胞貼壁24h后開始逐步升高，見圖1。

3　討論

不同組織來源的MSC具有相近的生物學特性，但較多研究也證實其不同特點，如臍帶中MSC含量明顯多于骨髓［5］，UC-MSC比BM-MSC有更快的增殖能力和更好的成骨分化能力，不同來源的MSC分泌的造血調控因子有差異［6］。本資料結果表明，BM-MSC和UC-MSC在體外分離培養無明顯差別，但骨髓標本較難獲得，也成為臨床應用的阻礙，在細胞表面標志方面，BM-MSC低表達HLA-DR抗原，提示UC-MSC與其相比具有更低的免疫原性。兩種間充質干細胞均在細胞貼壁24h后開始逐漸升高，也為臨床治療選用輸注細胞的時間提供參考，另外，BM-MSC較UC-MSC分泌大量的IL-6，IL-6與免疫反應，感染以及支持造血均有密切關系，對造血干/祖細胞的分化發育起重要的調控作用［7］，提示BM-MSC在免疫調控方面可能更有優勢。

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AIM To compare in vitro isolation﹑culture﹑immune phenotype and the concentrations of interleukin-6（IL-6）of the third passage of human bone marrow mesenchymal stem cells（BM-MSC） and umbilical cord tissue mesenchymal stem cells（UC-MSC）.METHODS Flow cytometry and Miliplex kit were used for the determination of phenotype and the concentrations of IL-6. RESULTS Two kinds of cells of P3 generation were high expression of CD90，CD105，CD44，CD73 and HLA-ABC antigens were not expressed CD14，CD34，CD45 and other hematopoietic cell related antigen. UC-MSC did not express HLA-DR antigen，BM-MSC low expression of HLA-DR antigen. BM-MSC at different time points of IL-6 secretion of hormone concentrations were higher in UC-MSC，both of which were gradually increased.CONCLUSION UC-MSC have lower immunogenicity，BM-MSC in the immune regulation has more advantages.

Bone marrow mesenchymal stem cells Umbilical cord mesenchymal stem cells Immune phenotype Interleukin 6

江蘇省科教興衛工程-臨床醫學中心（ZX201102）；江蘇省科技廳生命健康專項-BL2012005

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