不同免疫狀態下HBV患者樹突細胞免疫功能

姚運海　顧　靜　甘建和

不同免疫狀態下HBV患者樹突細胞免疫功能

姚運海顧靜甘建和★

目的 探討樹突細胞（DCs）在免疫清除期慢性乙型肝炎患者的免疫功能。方法 慢性乙肝病毒攜帶者40例，分為HBeAg（+）組（A組）20例，HBeAg（-）組（B組）20例，同期住院治療慢性乙肝患者40例，HBeAg（+）組（C組）與HBeAg（-）組（D組）各20例，健康體檢者20例為對照組（E組），分離單個核細胞（PBMC），誘導培養1周促使DC分化成熟，流式細胞術檢測底物CD86及CD14比例，ELISA檢測上清液IL-12濃度。結果 各組CD14比例分別為：A組2.42，B組3.74，C組3.38，D組4.89，與E組2.61比較差異有統計學意義（P＜0.05），A組例外（P＞0.05）；CD86結果分別為A組57.39，B組51.47，C組50.57，D組39.1，與E組62.38比較差異有統計學意義（P＜0.05）；ELISA檢測IL-12結果分別為A組83.06pg/ml，B組71.36pg/ml，C組59.58pg/ml，D組42.62pg/ml，除A組外其它組與E組87.74pg/ml比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 HBV患者外周血樹突細胞存在免疫缺陷，在免疫清除過程中，樹突細胞起著重要免疫作用。

慢性乙型肝炎 樹突細胞 CD86 CD14 白細胞介素12

乙型肝炎病毒（HBV）威脅著我國公共衛生安全，每年數以萬計患者死于終末期肝病。樹突細胞（DCs）作為重要的抗原提呈細胞，主要以DC1與DC2兩種形式存在于人體，CD14、CD86主要分泌于樹突細胞表面。白介素12（IL-12）是刺激DCs細胞分泌的關鍵因子，也是DCs分化成熟的最有效的活性因子，機體感染HBV后，IL-12分泌減少，DCs細胞間抗原提呈作用也減弱。作者通過粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）+白介素4（IL-4）誘導樹突細胞分化成熟方法，探討DC細胞在HBV患者免疫清除過程中的免疫作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 2013年12月至2014年5月本院門診慢性乙型肝炎病毒攜帶者40例，HBeAg陽性（A組）及HBeAg陰性（B組）患者各20例，其中男27例，女13例；年齡23～56歲，平均（37±13.5）歲。同期住院治療慢性乙型肝炎患者40例，HBeAg陽性（C組）及HBeAg陰性（D組）患者各20例，其中男31例，女9例；年齡27～52歲，平均（34±17.5）歲。以上入組患者均符合2010年制定的慢性乙型肝炎防治指南［1］。另選擇本院健康體檢者20例為陰性對照組，男15例，女5例；年齡22～47歲，平均（29±16.5）歲。各組均排除HAV、HCV、HDV、HEV等其他病毒性肝炎，同時排除血吸蟲性肝病、自身免疫性肝炎及酒精性肝病者，且近期均未使用過免疫調節類藥物。

1.2方法 （1）PBMC分離及樹突細胞培養：所有患者治療前及健康對照組均無菌備血30ml，聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離單個核細胞（PBMC），GM-CSF+IL-4誘導貼壁細胞1周，離心收集底物及上清液，洗滌備用上機檢測。（2）流式細胞術：將以上備用底物細胞加入PBS懸浮液懸浮，各自加入抗CD14-FITC、抗CD86-PE，避光孵育，對照管加入同型抗體Mouse IgG-FITC和Mouse IgG2bPE，分別洗滌，加入多聚甲醛固定，待上機檢測CD14、CD86比例。以上抗體購自美國BD公司，多聚甲醛由本院實驗室自配。（3）IL-12ELISA檢測：ELISA檢測試劑盒購自北京四正柏公司，操作嚴格按照說明書進行，結果以標準品濃度為橫坐標，光密度（OD）值為縱坐標，繪制標準曲線，通過OD值查出各自濃度值。

1.3統計學方法 采用EXCEL 2003和SPSS19.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1樹突細胞表面CD14、CD86檢測結果 見表1。

表1　各組樹突細胞表面CD14、CD86表達

2.2各組IL-12檢測結果比較 見表2。

表2　各組IL-12檢測結果比較

3　討論

HBV感染人體慢性化過程相當復雜，樹突細胞（DCs）是機體功能最強的抗原遞呈細胞（APCs），其高效的加工和遞呈抗原，成熟的DC能有效的活化幼稚T細胞，處于啟動、調控并維持免疫應答的中心環節，一方面傳遞LPS信息，刺激單核細胞增強免疫反應性和炎癥反應；另一方面介導單核細胞吞噬作用，從而在炎性反應及某些免疫病理反應中發揮重要作用［2，3］。HBV感染機體后啟動非特異性天然免疫應答，直接或間接影響B淋巴細胞分化成熟，激活體液免疫，與幼稚型T淋巴細胞協同抗原特異性CTL細胞［4，5］。同時免疫缺陷的樹突細胞增生低下，明顯影響其表面表達的共刺激分子，在肝臟組織中，活化DCs細胞并不能產生足夠的細胞因子［6］。

CD14、CD86是DC細胞表面特征性白細胞分化抗原，作為免疫球蛋白超家族及樹突細胞特征性因子，可誘導T淋巴細胞增殖及產生IL-2的主要協同因子。人體感染HBV后，DCs細胞分化成熟障礙表現在CD14、CD86表達異常［7］。作者通過體外GMCSF+IL-4誘導樹突細胞分化成熟的經典方法，使DC細胞分化成熟，實現對DC功能探索，結果發現慢性乙型肝炎患者組CD14表達最多，HBV攜帶者次之，且較E組差異有統計學意義（P＜0.05），CD86有著相反的變化趨勢，健康對照組CD86最高，HBV攜帶者次之，而慢性HBV患者最低，且較E組均存在統計學意義（P＜0.05）。有研究顯示在健康人群，肝臟庫普細胞極低水平表達CD14，而以大鼠肝損模型作為研究對象發現CD14 mRNA明顯增高，肝損也進一步加重［8］，其具體機制是LPS增加sCD14（可溶性CD14）水平［9］。同時HBV可以阻礙DC細胞分化成熟，CD86表達也下降［8］。另有研究認為接受乙肝疫苗治療的慢性乙肝患者的DC細胞表型及功能均存在缺陷，完全應答組DC細胞表面CD86表達也明顯增加［10］。

IL-12是DC釋放的最強的細胞活性因子，通過介導細胞免疫及體液免疫，顯著影響Th1、Th2平衡，參與病毒清除過程。IL-12是刺激DCs細胞分泌的關鍵因子，也是DCs分化成熟的最有效的活性因子，研究顯示，HBV感染者DC細胞出現免疫功能受損，其刺激T細胞增殖等能力下降，IL-12分泌也明顯下降，而通過IL-12的刺激作用，可以恢復HBV抗原特異性T細胞反應，表明IL-12參與乙型肝炎病毒清除［11，12］。本資料顯示HBV患者IL-12含量明顯下降，與E組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。有研究顯示慢性HBV感染宿主后通過阻止IL-12亞型P40、P70基因的轉錄，實現抑制DC細胞分泌IL-12［13］。進一步研究發現HBeAg陽性組較HBeAg陰性組高，且有統計學意義（P＜0.05），但乙肝病毒攜帶者HBeAg陽性組與健康對照組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。既往研究顯示宿主感染HBV后，DC分化成熟受到抑制，血清轉換后IL-12的分泌量有所增加［14］，可能與DC細胞活性恢復有關，具體的機制有待進一步研究。

綜上所述，HBV感染機體后，慢性活動性炎癥改變機制相當復雜，涉及抗原遞呈細胞DC對抗原的識別、淋巴細胞的功能及共刺激分子信號傳導等因素，DC細胞作為機體最強的抗原提呈細胞，參與免疫清除過程。CD14、CD86作為B7分子重要的共刺激分子，與受體結合介導作用不容忽視，IL-12作為重要的活性因子同樣發揮重要作用，各自在抗病毒過程中的作用有待進一步研究。

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Objective To investigate the different immune function of dendritic cells in hepatitis B patients with different immune status. Methods 40 Chronic hepatitis B carriers came from outpatient，including 20 HBeAg（+）patients （group A） and 20 HBeAg（-）ones（group B）. 40 HBV patients came from inpatient，including 20 HBeAg（+）patients （group C） and 20 HBeAg（-）ones （group D）. 20 healthy volunteers were recruited as control group E.PBMC were got from their peripheral blood. Mature DCs obtained from the sterile culture one week later. Flow cytometry to detect CD14 and CD86 in substation，ELISA detect IL-12. Results CD14 rates： Group A 2.42，group B 3.74，groupC3.38，groupD 4.89，they did differ signifi cantly with group E 2.61（P＜0.05），except group A（P＞0.05）. CD86 rates： Group A 57.39，group B 51.47，group C50.57，group D 39.1，signifi cantly different with group E 62.38（P＜0.05）.Il-12 concentration： Group A 83.06pg/ml，group B 71.36pg/ml，group C 59.58pg/ml，group D 42.62pg/ml，signifi cantly different with group E87.74（P＜0.05） except group A. Conclusions DCs in HBV patients have immune defi ciencies，and in the process of immune clearance，these defi ciencies are more obvious.

Chronic hepatitis B Dendritic cells CD86 CD14 IL-12

215006 蘇州大學附屬第一醫院感染科