大鼠Ⅰ型肌醇三磷酸受體多種突變體的載體構建

王梅芳　程雪琴　封婷婷　李瑞明　唐以軍

·實驗研究·

大鼠Ⅰ型肌醇三磷酸受體多種突變體的載體構建

王梅芳程雪琴封婷婷李瑞明唐以軍★

目的 構建大鼠Ⅰ型肌醇三磷酸受體（IP3R1）多種突變體真核表達載體。方法 以pcDNA3.0-IP3R1 WT為模板，利用重組融合的方法定點突變構建3個突變體，根據點突變的位置分別命名為G2586A﹑I2588V ﹑R2596A。結果 構建的3個突變體，經PCR﹑酶切﹑測序，3個位點的突變完全達到預期設計。結論 成功構建3個突變體，為進一步研究IP3R1對大鼠平滑肌細胞中胞漿內Ca2+濃度的調控作用奠定基礎。

IP3R1 載體構建 定點突變 Ca2+

氣道平滑肌細胞在哮喘發作、疾病進展過程中起著重要作用。其病理生理反應均受細胞內鈣離子（Ca2+）調節完成［1］。肌醇三磷酸受體（IP3R）作為內質網上調節胞漿Ca2+濃度的關鍵通道，其活性受到復雜信號網絡的精細調節，IP3和Ca2+的調節起著至關重要的作用。2014年2月至2015年1月作者通過構建大鼠IP3R1的突變體，改變IP3R1的C-末端區氨基酸表達，進而調節其對鈣離子的敏感性。以期為治療哮喘患者氣道平滑肌細胞重塑和對外界因子刺激的過度反應提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料 （1）質粒載體與菌株：pcDNA3.1-IP3R1 WT由加拿大卡爾加里大學亞伯達心血管機構生理學和藥理學部門惠贈；Ecoli DH5α 購自天根生化科技有限公司。（2）試劑：BsmBI、EcoRI、XhoI、BamHI、DNA Marker、T4 DNA Ligase均購自NEB公司，質粒提取試劑盒購自AXYGEN公司，PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Fast HiFidelity Polymerase購自天跟生化科技有限公司。

1.2方法 （1）突變質粒的構建：首先以pcDNA3.0-IP3R1 WT為模板，使用BsmBI進行酶切，獲取具有粘性末端的大片段（13000bp左右），將該片段命名為B。BsmBI的酶切體系：ddH2O 7.5μl，BsmBI 0.5μl，3.1*Buffer 2μl，模板 30μl，55℃ 4h。以pcDNA3.0-IP3R1 WT為模板，使用的引物見表1。反應體系：ddH2O 34.5μl，Fast HiFidelity Polymerase 0.5μl，5* Fast HiFidelityPCR Buffer10μl，上游引物2μl，下游引物2μl，DNA模板1μl。反應條件：預變性94℃2min，變性94℃ 15s，退火和延伸68℃ 30s，循環35次，68℃延伸5min。其擴增的產物分別命名為A1、A2、A3、A4、A5，分別將兩個目的片段 A1 和 A3 、A2和A3、A4和A5的 PCR 擴增回收產物進行融合PCR 擴增，反應體系：ddH2O 35μl，Fast HiFidelity Polymerase 0.5μl，5* Fast HiFidelity PCR Buffer10μl，500bp-模板 2μl，280bp-模板 1.5μl，反應條件：預變性94℃ 2min，變性94℃ 15s，退火50℃ 1min和延伸68℃1min，循環5次后，加入引物7809U 0.5μl，引物9228D 0.5μl，預變性94℃ 2min，變性94℃ 15s，退火和延伸68℃ 30s，循環18次，獲得 A1-A3 、A2-A3、A4-A5預計大小的片段。采用BsmBI分別對A1-A3 、A2-A3、A4-A5進行酶切，將酶切后的產物分別與F片段進行連接。將連接產物轉入Ecoli DH5α，37℃160rpm搖菌1h，鋪在含氨芐抗性的LB平板上，37℃過夜。（2）突變pcDNA3.0-IP3R1 WT質粒的篩選與序列分析 經含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養過夜后提取質粒，通過PCR、 EcoRI/XhoI酶和BamHI酶對陽性重組質粒pcDNA3.0-IP3R1進行鑒定，將陽性克隆子送武漢擎科生物技術有限公司雙向測序，并對測序的結果進行人工核實，應用NCBI網站中的BLAST操作平臺，將所核實的序列與GenBank中注冊的Rattusnorvegicus IP3R1序列進行同源性比較，將所測序列在Lasergen7.1中的Megalign軟件中比較分析。所發生SNPs變化序列使用Chromas 軟件人工核實，將陽性克隆子送上海生工生物工程股份有限公司進行重復測序核實。PCR鑒定陽性克隆子所用上、下游引物序列分別為5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’（T7）和5'-AGCAAAGGTGTCGATGATGACCCCAAAAATGAGGT TCA-3’（8091D）。酶切體系：ddH2O 15.5μl，BamHI（EcoRI/ XhoI）0.5μl，3.1*Buffer 2μl，模板 2μl。

表1　定點突變引物的序列信息

2　結果

2.1突變質粒的構建與鑒定 構建C端的點位點突變，根據其突變的位置分別命名為G2586A（甘氨酸置換為丙氨酸）突變體、I2588V（異亮氨酸置換為纈氨酸）突變體 、R2596A（精氨酸置換為丙氨酸）突變體，使用引物8091D-T7進行PCR鑒定，經BamHI單酶切有三條特異帶，大小分別是2532bp、3851bp、8086bp（見圖1A）；ECORI/ XHOI雙酶切后，大小分別是9041bp、5428bp （見圖1B）。

圖1　G2586A突變體﹑I2588V突變體 ﹑R2596A突變體的酶切鑒定

2.2序列分析 將鑒定為陽性的克隆子，送擎科生物技術有限公司測序，采用Lasergen7.1中的Megalign軟件對突變的序列與Rattus norvegicus序列進行比較，完全達到預期的設計 （見圖2）。

圖2　3個突變體的序列與Rattus norvegicus序列比較

3　討論

哮喘是一種由多種細胞（嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等） 和多種細胞組分共同參與的以氣道高反應性和氣道炎癥為特征的免疫變態反應性疾病。支氣管平滑肌細胞是哮喘氣道高反應時氣道結構變化的主要效應細胞。Ca2+通道對調節氣管平滑肌細胞的興奮-收縮耦聯起重要作用［2］。在大鼠支氣管平滑肌細胞中，IP3R是介導Ca2+從內質網向胞漿內轉移的主要通道，其激活受IP3和 Ca2+的雙向調節。IP3R幾乎表達于所有的動物細胞，包括IP3R1、IP3R2、IP3R3三個亞型，由四聚體組成，每個單體由IP3結合結構域（第1～576個氨基酸區間）、偶聯區域/調節區域（第576～2276個氨基酸區間）、C端的6個跨膜區域（Ca2+通道孔，第2276～2590個氨基酸區間）、C末端（第2590～2749個氨基酸區間）組成［3］。其中IP3結合結構域包括抑制結構域（SD第1～224個氨基酸區間）和IP3結合孔（IBC第224～576個氨基酸區間）。IP3結合IP3R的N端IBC區，通過其鄰近的SD區作用于C端的第4，5跨膜區間的α螺旋環，來介導Ca2+通道的開放［4］。Ca2+通道孔由IP3R1的每個單體第5，6跨膜區及連接二者間的腔環（第2398～2589個氨基酸區間）形成［5］。目前該通道的門控和滲透機制尚未清楚，隨著基因突變被廣泛的應用于較多離子通道的結構功能關系研究，結果表明這些通道的保守疏水性殘基限制離子流過第6跨膜區螺旋交叉口的狹窄孔，推測IP3R1的 C端的第6跨膜區的氨基酸可能是介導門控和滲透機制的重要區域［6，7］。Bhanumathy等［8］對第6跨膜區線性螺旋的胞質區的10個氨基酸突變，結果表明位點A2596 、I2588 和I2589的突變使Ca2+通道功能失活，表明其可以調節通道門控。

將BsmBI酶切好的小片段（750bp）與大片段B進行同源重組連接，結果顯示引物下游連接到了大片段對應的位置，但上游處并無與對應的位置相連，連接錯誤。為避免這種錯誤，采用T4 DNA Ligase進行連接，結果顯示引物下游連接到了大片段B對應的位置，但上游連接到pcDNA3.1上，考慮到BsmBI的酶切位點5’ CGTCTC（N）1＾3’和3’GCAGAG（N）5＾5’隨著IP3R的結構和功能研究深入，已逐漸發現其在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。目前已有研究表明，Ca2+信號參與細胞自我吞噬過程，在細胞不同狀態下可抑制或促進自我吞噬，而自我吞噬下調涉及到癌癥的進程，ITPR1（編碼IP3R1蛋白）作為一種自我吞噬基因，已證實其可用于胸部腫瘤患者預后無轉移生存率的預測，另外通過干擾抗凋亡分子B細胞性淋巴瘤-xl（Bcl-xl）蛋白與IP3R1蛋白的相互作用具有一定的抗腫瘤作用［9～12］。近期研究還發現IP3R1的突變和缺失引起小鼠肌張力障礙、共濟失調和人類15亞型脊髓小腦變性癥（SCA15）［13，14］。但有關平滑肌細胞中IP3R的改變對Ca2+信號通路影響的相關報道較少，本研究中成功構建G2586A、I2588V、R2596A3個突變體，為后期轉染原代平滑肌細胞奠定基礎。

比較特殊，通過延伸定點突變的引物的長度，增加保護堿基，保證基因剪切及連接的方向性和特異性，成功構建G2586A、I2588V、R2596A3個突變體。

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Objective The different mutants of eukaryotic expression vectors of Rattus norvegicus IP3R1 were constructed Methods The pcDNA3.0-IP3R1 WT was used as a template to construct three mutants by the method of recombinant fusion，and according to the position of the point mutation，they were named as G2586A，I2588V，R2596A，respectively. Results The three mutants were confi rmed by using PCR，enzyme digestion，sequencing，and achived the expected design Conclusion The three successfμl mutants lay the foundation for the further study on the regμlatory effect of IP3R1 on Ca2+concentration in cytoplasm of smooth muscle cells.

IP3R1 vector construction site-directed mutagenesis Ca2+

國家自然科學基金資助項目（81270092）

442000 湖北醫藥學院附屬太和醫院呼吸內科呼吸疾病研究所（王梅芳 程雪琴 封婷婷 唐以軍）442000 湖北省十堰市太和醫院生物醫學研究所（李瑞明）