水貂養殖舍中細菌氣溶膠與氣載內毒素檢測

鐘召兵

（泰安市岱岳區畜牧獸醫局，山東泰安 271000）

水貂養殖舍中細菌氣溶膠與氣載內毒素檢測

鐘召兵

（泰安市岱岳區畜牧獸醫局，山東泰安 271000）

［目的］本研究旨在了解水貂舍細菌氣溶膠和氣載內毒素對環境的污染及對飼養人員健康的潛在危害。［方法］采用Andersen-6空氣收集器和AG?-30液體沖擊式采樣器對市郊不同飼養條件的2個水貂場6棟養殖舍內的細菌氣溶膠和氣載內毒素進行定期檢測。［結果］兩個場舍內氣載需氧革蘭氏陰性菌濃度分別介于4.17×101～2.43×103CFU/m3之間和4.27×101～5.1×103CFU/m3之間，以大腸桿菌科為主，假單胞菌屬和巴斯德氏菌屬次之；從革蘭氏陰性菌在Andersen-6空氣收集器層級上的分布規律來看，主要分布在Ⅲ級（36.9%），氣溶膠顆粒直徑在2～6 mm之間。兩個場舍內的氣載內毒素濃度分別介于2.92×102～2.15×103EU/m3之間和2.67×101～2.56×102EU/m3之間。［結論］水貂舍內氣溶膠顆粒可以進入到動物和人的支氣管、細支氣管，甚至肺泡，在一定程度上增加了水貂和飼養人員呼吸道疾病發生的可能性；氣載內毒素的濃度部分超出了對人體無影響的推薦標準（1.0×102EU/m3），可對水貂飼養人員的健康造成一定的危害；舍內氣載革蘭氏陰性菌與內毒素之間沒有必然的相關性，表明空氣中氣載內毒素含量不能用空氣中氣載革蘭氏陰性菌的含量來評估。

水貂場；環境；氣載需氧革蘭氏陰性菌；氣載內毒素

空氣微生物的污染程度是衡量空氣質量的重要指標之一。國外在畜禽舍環境與人類和動物的健康方面已做過很多研究［1］，空氣中病原微生物可導致畜禽呼吸道感染［2］；高濃度的非病原微生物可導致機體免疫負荷過重，抵抗力降低，易感性升高［3］。特別是空氣中的微生物及其代謝產物（內毒素、氨、硫化氫等）是影響動物健康的因素［4］。畜禽舍環境中微生物氣溶膠不僅對畜禽和養殖人員的健康造成威脅，還對外界環境造成生物污染［5］。

細菌內毒素來源于革蘭氏陰性菌細胞外壁，是其死亡或菌體裂解時釋放出來的一類具有多種生物活性的毒性物質，可對機體產生毒害作用，如熱源性、白細胞減少癥、Shwartzman反應、內毒素毒血癥和休克等［6］，因此對動物舍內氣載內毒素檢測有其必要性和重要性。

畜禽舍細菌氣溶膠和氣載內毒素對人類健康的影響在國外已有研究報道［7］，而對水貂舍內空氣中細菌和內毒素檢測以及內毒素和革蘭氏陰性菌相關性的研究迄今為止國內外還沒有報道。因此，本研究對水貂舍氣載內毒素和氣載革蘭氏陰性細菌的濃度進行檢測并分析其危害，對兩者是否存在相關性做了研究，旨在對水貂養殖環境空氣質量做出客觀評價。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑、培養基。血瓊脂基礎（上海伊華醫學科技有限公司）、50 mL/瓶的細菌內毒素檢查用水（湛江經濟技術開發區海洋生物制品廠）、LAL試 劑（0.1 mL/支，λ=0.125 EU/mL）（ 湛江博康海洋生物有限公司）、細菌內毒素標準品CSE（10 EU/支）（湛江博康海洋生物有限公司）。1.1.2 主要儀器。Andersen-6級撞擊式微生物樣品收集器（遼寧市應用技術研究所）、AG?-30液體沖擊式采樣器（遼陽市醫療器械廠）、DEM6型輕便三杯風向風速表（天津市氣象海洋儀器廠）、DH4000A型電熱恒溫培養箱（中國天津市泰斯特儀器有限公司）、YOX型厭氧培養箱（上海躍進醫療器械廠）、無菌超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司制造）。

1.2方法

1.2.1血瓊脂培養基的制備。將血瓊脂基礎滅菌后加5%公綿羊血制成血瓊脂培養基。

1.2.2水貂舍的選擇。選擇A、B兩個開放式和半封閉式水貂養殖場進行研究。其中，場A為開放式籠養，遠離公路，占地約50畝，飼養水貂1100只左右；貂舍呈東西走向，背風向陽；采樣地點為育成貂和仔貂舍A1、A2、A3，每棟舍長30 m、寬4 m、高2.5 m，養貂300只，通風條件良好；場B為半封閉式籠養，近鄰國道，占地30畝，飼養水貂500只左右；貂舍呈東西走向；采樣地點育成貂舍B1、B2、B3，舍長16m，寬4m，高2.5m，每舍養貂150只，自然通風，具體數據見表1。

表1 被研究的2個水貂場情況

1.2.3舍內空氣樣品采集。采用國際標準ANDERSEN-6級［8］空氣微生物樣品收集器（遼寧市應用技術研究所），置于水貂舍中央、高1 m、空氣流量為28.3 L / min處，采樣介質為血-葡萄糖-瓊脂培養基，驅動時間1～5 min。

1.2.4舍內空氣內毒素采集。通過國際標準AG?-30液體沖擊式采樣器（All Glass ?mpinger AG?-30）和鱟變形細胞溶解物試驗（Limulus Amebocyte Lysate Test）測得。將收集器置于舍中央、高80 cm處，采樣介質為50 mL內毒素檢查用水（湛江海洋生物制品廠），空氣流量為12.5 L/min，驅動時間30 min。

1.2.5舍內空氣中革蘭氏陰性菌的分離、鑒定與濃度計算。一半（72個）樣本放入YQX型厭氧培養箱中（88%N2、7%H2、5%CO2），40 ℃培養24～48 h；另一半（72個）置于培養箱37℃培養24～48 h，陽性菌落經過“KOH 反應”試驗鑒定其是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌。將革蘭氏陰性菌通過O-F（氧化-發酵）試驗和氧化酶試驗分成腸桿菌科類和非發酵類，分別用AP?-20E和AP?- 20NE進行鑒定，經Andersen校正表校正后，計算出環境空氣中細菌的濃度（CFU/m3）和氣載革蘭氏陰性菌濃度（CFU/m3）［9］。

2　結果

2.1數據分析

舍內空氣微生物數據呈非正態分布，為減少誤差達到準確反應實際真值的目的，水貂舍環境氣載內毒素和細菌濃度采用了中間值（Median）［10］，這種統計方法適用于數量較少數值浮動較大的樣本統計，同時用最大值與最小值反映數值的波動范圍，并應用Microsoft Excel 對參數進行了相關性和回歸分析。

2.2舍內氣載細菌在Andersen-6級生物采集器各層級上的分布特征

Andersen-6級生物采集器Ⅰ-Ⅱ級收集的細菌粒子（＞6.0 mm）可沉著在小支氣管內，Ⅲ-Ⅵ級收集的粒子（≤6.0 mm）可直接侵入肺泡。不同種類細菌粒子因直徑大小不同，在不同級別上的分布比例也不同，氣載細菌總體分布在Ⅰ～Ⅴ層。貂舍內氣載細菌在Andersen-6級生物采集器各層級上的分布用每一層級捕獲的細菌粒子數占采樣器捕獲的細菌粒子總數之比計算，具體數據見表2。

2.3貂舍內細菌氣溶膠的濃度

場A與場B舍內空氣中需氧菌濃度分別在4.32×102～2.35×104CFU/m3和 4.63×102～2.78×104CFU/ m3之間，厭氧菌濃度分別在6.18×102～1.12×104CFU/m3和 1.31×103～1.22×104CFU/ m3之間，具體數據見表3。

2.4貂舍內革蘭氏陰性菌氣溶膠的濃度

場A、場B舍內需氧革蘭氏陰性菌的濃度分別在4.17×101～2.43×103CFU/m3和4.27×101～5.1×103CFU/m3之間，具體數據見表4，沒有分離出氣載厭氧革蘭氏陰性菌。

2.5貂舍內氣載內毒素的濃度

場A、場B舍內氣載內毒素的濃度分別在2.92×102～2.15×103EU/m3和 2.67×101～2.56×102EU/m3之間，具體數據見表4，部分數據已超出了推薦的健康標準（1.0×102EU/m3）［11］。

2.5貂舍內氣載需氧革蘭氏陰性菌的菌群組成

場A、場B舍內空氣中需氧革蘭氏陰性菌以腸桿菌科為主，其中，大腸埃希氏菌占優勢，巴氏桿菌屬和假單胞菌屬細菌濃度相近，巴氏桿菌屬以多殺性巴氏桿菌最高，假單胞菌以銅綠假單胞菌為主。此外也檢測到不常見的成團泛桿菌和成團腸桿菌，具體數據見表5、表6。

表2　水貂場舍內氣載細菌在Andersen-6級生物采集器各層級上的分布（%）

表3　水貂場A和B舍內氣載需氧活菌和氣載厭氧活菌濃度

表4　水貂場A和B舍內氣載需氧革蘭氏陰性活菌和氣載內毒素濃度

表5　水貂場A中需氧革蘭氏陰性細菌的菌群構成

表6　水貂場B中需氧革蘭氏陰性細菌的菌群構成

2.6貂舍空氣中內毒素與革蘭氏陰性菌的相關性分析

對水貂場A和B舍內空氣中細菌內毒素和氣載革蘭氏陰性菌之間的相關性進行統計分析，結果表明，氣載內毒素與氣載革蘭氏陰性菌之間相關系數r1和r2不顯著，氣載革蘭氏陰性菌與氣載內毒素沒有必然的相關性，因此不可以用水貂舍氣載革蘭氏陰性菌濃度來估測氣載內毒素，具體數據見表7。

表7　水貂場A和B舍內氣載內毒素與革蘭氏陰性菌之間的關系

3　討論

3.1水貂場舍內氣載細菌氣溶膠的潛在危害

本研究采用Andersen-6級空氣微生物收集器，采集粒譜范圍在0.2～20 mm，可以統計各種直徑粒子的數量，了解微生物氣溶膠顆粒空氣動力學直徑（Dae50）大小，評估它們的傳播距離和進入呼吸道的深度，判斷能否進入肺泡和在空氣中懸浮時間，間接推斷對人及動物造成的危害程度。

兩個水貂場舍內細菌氣溶膠顆粒在Andersen-6收集器6個層級上的分布（表2）看出，場A和B舍內氣載細菌在 Andersen-6級生物空氣采樣器上的粒徑分布趨勢基本相同。氣載細菌主要分布在Ⅱ和Ⅳ級（捕獲范圍2.0～8.2 mm），最低值在Ⅵ級（＜0.65 mm）。根據飼養人員和水貂的吸氣量以及在舍內的停留時間（飼養人員8 h，水貂24 h），人和水貂在1 d內可吸入3.1×103 CFU和5.4×104 CFU氣載細菌，其中Ⅰ級和Ⅱ級上的氣載細菌可進入人和水貂的鼻腔和上呼吸道，這些顆粒在空氣中懸浮時間短，最多能通過鼻腔到達氣管，但由于重力作用將很快沉落，一般情況下，對人和動物的威脅不大；但Ⅲ-Ⅵ級的氣載細菌可以沉著在人和水貂的小支氣管或直接侵入肺泡，對人和動物的健康構成威脅。

3.2水貂場舍內氣載革蘭氏陰性菌

本研究主要對兩個水貂場舍內空氣中的氣載革蘭氏陰性菌的組成和含量進行了分析，結果顯示革蘭氏陰性病原菌的濃度很低，雖然沒有文獻報道水貂舍內氣載革蘭氏陰性菌的標準范圍，但是不能忽視它們對舍內環境空氣的影響。

檢測結果顯示，氣載革蘭氏陰性菌群主要包括腸桿菌、巴氏桿菌和假單胞菌。其中，腸桿菌科在兩個水貂場舍內空氣的革蘭氏陰性菌中占大多數，以大腸桿菌最多，這同報道的畜禽舍的情況基本一致［12-13］，都沒有檢出厭氧革蘭氏陰性菌。高濃度非病原菌會導致機體免疫力降低，使病原菌侵入機體的可能性增加。

在兩個水貂場內檢測到很多種假單胞菌屬，其是常見的條件致病菌，感染途徑主要通過呼吸道，可引起人的肺炎、肺栓塞、手術創傷感染、菌血癥與敗血癥等病癥［14］。另外在兩個場中還分離到巴氏桿菌，其中多殺巴氏桿菌能導致人上呼吸道感染以及生殖道感染等病癥。

場A舍內還分離到了雞巴氏桿菌，分析可能與舍內有雞混養有關；還分離到了不常見的成團腸桿菌和成團泛桿菌，含量極少。成團腸桿菌是免疫系統缺陷病人的條件致病菌，常侵犯新生兒和創傷病人。

場B舍內氣載革蘭氏陰性菌濃度比場A高（表3），可能與這兩個場的養殖環境有關，場A是開放式養殖，通風狀況良好，有一套完整有序的消毒和疾病控制體系；場B是半封閉式養殖，通風條件相對較差并且雞狗混養，這些因素都可導致氣載致病性革蘭氏陰性菌濃度升高。

從水貂場舍內空氣中分離的氣載革蘭氏陰性菌群組成及濃度反映出水貂場存在發生疾病的潛在危險，尤其對在半封閉式水貂場內的飼養人員和動物的健康危害更大。

3.3水貂場舍內空氣中內毒素

國外研究表明，空氣中內毒素可以造成人及動物嚴重的呼吸道刺激反應［15］；氣載內毒素含量與動物疾病的發生有協同作用，長期暴露在有氣載內毒素存在的環境中，可導致肺功能下降，甚至導致免疫性疾病［16］。Halloy通過研究內毒素含量對豬的健康影響，表明氣載內毒素可以導致豬發生多方面呼吸道疾病［17］，Donham通過相關性和回歸性分析發現了重要的劑量反應關系，指出0.16 mg/m3可被吸入的塵埃，614 EU/m3的內毒素以及12ppm的氨氣與肺部損傷有很大的相關性［18］。

本研究在兩個不同水貂場舍內測得氣載內毒素含量在2.67×101～2.15×103EU/m3之間，部分已超過引起人的肺炎推薦標準（2.0×103EU/m3），大部分已經超了對人體健康無影響推薦標準（1.0×102EU/m3）。對長期生活在這種環境中的動物和飼養人員的健康會產生很大的危害。然而舍內氣載內毒素對動物和飼養人員的健康會產生多大的危害及其含量在多少之內不會影響動物和人的健康等問題，還有待研究。

3.4水貂舍內氣載革蘭氏陰性菌與氣載內毒素的相關性

通過舍內氣載革蘭氏陰性菌與內毒素的相關性分析，說明兩者之間沒有必然的相關性，且氣載內毒素依賴于氣載革蘭氏陰性菌的回歸方程（見表7）也不顯著（P＞0.05）。表明空氣中氣載內毒素含量不能用空氣中氣載革蘭氏陰性菌的含量來評估。氣載內毒素的活性可保持數月，其含量可以積累，而革蘭氏陰性細菌在空氣中存活時間短，采樣過程也可使其活性喪失［19-20］。

綜上所述，水貂舍環境中高含量的氣載細菌和氣載內毒素，不僅會危及人和動物的健康，還可能造成周圍環境的空氣污染。盡管在采樣過程中未觀察到人和水貂的異常表現，但長期暴露在這種環境中會給人和動物的健康造成危害，因此關注畜禽養殖環境衛生是健康養殖的重要環節。

［1］Donaldson A ?，Gloster J，Harvey L D，et al. Use of prediction models to forecast and analyse airborne spread during the foot-and-mouth disease outbreaks in Brittany，Jersey and the ?sle of Wight in 1981 ［J］. Veterinary Record，1982，110：53-57.

［2］Weiss R A，McMichael A J. Social and environmental risk factors in the emergence of infectious diseases ［J］.Nature Medicine，2004，10（12）：70-76.

［3］Jarnych V S. Aerosole in der Veterinaermedizin［J］.VEB Deutsche Landwirtschaftsverlag Berlin，1976，23：74-88.

［4］Wathes C M，Holden，Sneath M R，et al. Concentrations and emission rates of aerial ammonia，nitrous oxide，methane，carbondioxide，dustand endotoxin in UK broiler and layer houses［J］.British Poultry Science，1997，38（1）：14-28.

［5］Alex Donaldson. Airborne spread of foot-and-mouth disease［J］. Microbiology Today，1999，26：118-119.

［6］Urbain B，Prouvost J F，Beerens D，et al.Chronic exposure of pigs to airborne dust and endotoxins in an environmental chamber：technical note［J］.Veterinary Research，1996，27（6）：569-578.

［7］Tanner M K，Swinker A M，Beard M L，ea tl. Effect of phone book paper versus sawdust and straw bedding on the presence of airborne Gram-negative bacteria，fungi and endotoxin in horse stalls［J］. Journal of Equine Veterinary Science，1998，18（7）：457-461.

［8］Andersen A.New sampler for the collection，sizing，and enumeration of viable airborne particles ［J］. Journal Bacterial，1958，76：471-484.

［9］于璽華，車鳳翔.現代空氣微生物學及采檢鑒技術［M］. 第一版. 北京：軍事醫學科學出版社，1998：89-98，153-155.

［10］金丕煥. 醫學統計方法［M］. 上海：上海醫科大學出版社，1992：20-21.

［11］Rylander R. The role of endotoxin for reaction after exposure to cotton dust［J］. American Journal of ?ndustrial Medicine，1987，12：687-697.

［12］Duan H Y，Chai T J，Mueller W，et al.Concentration ofairborne endotoxins and airborne bacteria in Chinese rabbit houses［J］. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift，2006，119： 1-2，40-44.

［13］Chai T J，Muller W，Zucker B A. et al. Airborne anaerobic bacteria in a calf house with special regard to Clostridium perfringens［J］. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift，1997，110（1）：1-4.

［14］Oie S，Kamiya A. Microbial contamination of enteral feeding solution and its prevention［J］.American Journal of ?nfection Control，1992，20（4）：202-205.

［15］Dutkiewicz J，Pomorski Z J H.Airborne microorganisms and endotoxin in animal houses［J］. Grana，1994，33（2）：85-90.

［16］Donham K J. Association of environmental air contaminants with disease and productivity in swine［J］. American Journal of Veterinary Research，1991，52（10）：1723-1730.

［17］Halloy D J，Kirschvink N A，Vincke G L.et al. A screening method to investigate airway reactivity and acute lung injuries in freely moving pigs［J］. The Veterinary Journal，2004，168（3）：276-284.

［18］Donham K J. The concentration of swine production： effects on swine health，productivity，human health，and the environment［J］.Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice，2000，16：559-597.

［19］Zucker B A，Muller W. Relationship between inhaled endotoxins，dust and airborne bacteria in a poultry housi-ng unit［J］. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift，2000，113（8）：279-283.

［20］Zucker B A，Muller W. Airborne gram-negative bacteria and airborne endotoxin in pig houses［J］. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift，2002，115：1-2，30-36.

（責任編輯：朱迪國）

Detection of Bacterial Aerosol and Airborne Endotoxin in Mink Breeding Houses

Zhong Zhaobing
（Daiyue District Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Tai，an，Shandong 271000）

［Objective］The purpose of the study is to understand bacterial aerosol and airborne endotoxin pollution in the mink stables and the potential health hazards to mink breeders. ［Methods］Concentrations of bacteria aerosol and airborne endotoxin were measured by Andersen-6 stage sampler and AG?-30（All Glass ?mpinger AG?-30） in six stables of two mink farms in the suburbs. ［Results］Concentrations of airborne aerobic gram-negative bacteria were 4.17×101to 2.43×103CFU/m3and 4.27×101to 5.1×103CFU/m3respectively in the two farms with Enterobacteriaceae as the predominant species flowed by Pasteurella and the Pseudomonas. The airborne gram-negative bacteria were mainly distributed in the Ⅲ stage（36.9%）of Andersen-6 stage sampler，with aerosol particle diameters ranging from 2μm to 6μm. Concentrations of airborne endotoxin in two mink farms were 2.92×102to 2.15×103EU/m3and 2.67×101to 2.56×102EU/m3respectively.［Conclusion］The pollution of aerosol aerobic gram-negative bacteria detected in the mink stables，although with very low concentration，would increase possibilities of minks and the breeders to suffer from respiratory diseases. Concentrations of airborne endotoxin was above the recommended standard for human health（1.0×102EU/m3）and would have certain threat to the health of mink breeders. There is no inevitable correlation between the airborne gram-negative bacteria and endotoxins in mink houses，suggesting that airborne endotoxin concentrations can not be used to assess the concentration of gram-negative bacteria.

mink field；environment；airborne aerobic gram-negative bacteria；airborne endotoxin

S851.2+4

B

1005-944X（2015）11-0022-05