H5N1禽流感疫苗研究進(jìn)展及免疫效果影響因素分析

蔣文明，陳繼明

（中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032）

H5N1禽流感疫苗研究進(jìn)展及免疫效果影響因素分析

蔣文明，陳繼明

（中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

免疫接種在H5N1 高致病性禽流感的防控中發(fā)揮了重要作用，但是影響疫苗效率的因素很多，需要進(jìn)一步改進(jìn)和提高。本文對(duì)當(dāng)前H5N1亞型禽流感滅活疫苗、載體疫苗、減毒活疫苗的使用狀況和研究進(jìn)展，以及影響疫苗效率的因素（免疫持續(xù)期、疫苗的抗原匹配性、疫苗生產(chǎn)、佐劑、母源抗體干擾）進(jìn)行了綜述。

禽流感病毒；H5N1；疫苗；免疫接種；研究進(jìn)展；影響因素

1996年以來，全球有63個(gè)國家暴發(fā)過H5N1亞型高致病性禽流感（H5N1 HPA?），超過2.5億的家禽或野生鳥類因此死亡。為了控制該病，中國、印尼、越南、埃及和孟加拉國等國家實(shí)施了禽流感疫苗免疫接種。從禽流感的流行病學(xué)和目前的流行狀況來看，很難在短時(shí)間內(nèi)將H5N1 HPA?病毒從家禽中消除，所以認(rèn)為H5N1 HPA?的免疫還會(huì)持續(xù)相當(dāng)長的一段時(shí)間。下面對(duì)當(dāng)前H5N1 HPA?疫苗的使用狀況和研究進(jìn)展，以及影響疫苗效率的因素做一介紹。

1　當(dāng)前疫苗使用狀況及研究進(jìn)展

1.1滅活疫苗

到目前為止，大多數(shù)H5N1疫苗是滅活的油乳佐劑疫苗。最開始階段H5滅活疫苗只有少數(shù)種子毒株可用：A/chicken/Hidalgo（Mexico）/94（H5N2）（Mex/94）、A/turkey/England/N28/73（H5N3）、A/turkey/Wisconsin/68（H5N9）、A/chicken/?taly/22A/98（H5N9）、A/chicken/Legok（?ndonesia）/03（H5N1）和A/duck/Novosibirsk/02/05（H5N1）（表1）。2006年，利用反向遺傳技術(shù)開發(fā)了表達(dá)A/goose/Guangdong/1/96血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）基因的重組病毒Re-1。

2008年之前，Re-1一直是中國主要的疫苗種子株，一些疫苗出口到印尼、越南和埃及。但是隨著流行毒抗原的變異，Re-1已經(jīng)被更有效的疫苗種子取代。2008年中期，Re-5（HA和NA來自于A/duck/Anhui/1/2006，2.3.4分支）成為主要的疫苗種子株。2012年中期，Re-6（HA和NA來自于A/duck/Guangdong/S1322/2010，2.3.2分支）成為主要的疫苗種子毒株。此外，在重組疫苗方面還開發(fā)和使用了Re-4（HA和NA來自于A/chicken/ Shanxi/2/2006，第7分支）、Re-7（HA和NA來自于A/Chicken/Liaoning/S4092/2011，第7.2分支），2014年取代Re-4和Re-Egypt（HA和NA來自于A/chicken/Egypt/18-H/2008，第2.2.1分支）。所有這些反向遺傳重組疫苗都使用雞胚高產(chǎn)的PR8病毒作為骨架。

表1 臨床使用的H5N1 HPA?V油乳劑滅活疫苗種子株

1.2載體疫苗

目前已有大量H5N1 HPA?V重組病毒載體或細(xì)菌載體疫苗的報(bào)道，如禽痘病毒（fowlpox virus，rFPV）、火雞皰疹病毒（herpesvirus of turkeys，rHVT）、新城疫病毒（newcastle disease virus，rNDV）、傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，r?LTV）、腺病毒（adenovirus，rAd）和沙門氏菌載體疫苗，但到目前為止只有rFPV、rNDV和rHVT三個(gè)載體疫苗獲得了批準(zhǔn)。相比滅活疫苗，載體疫苗有幾個(gè)優(yōu)勢：對(duì)復(fù)制病毒有良好的免疫反應(yīng)；無需佐劑；所需抗原量低；可以大規(guī)模應(yīng)用。

1.2.1rHVT載體疫苗。rHVT載體疫苗具有雞胚內(nèi)接種的優(yōu)勢，從而節(jié)省勞動(dòng)力，降低母源抗體干擾。

1.2.2rNDV載體疫苗。rNDV載體疫苗具有很多優(yōu)勢，可以通過孵化器噴霧或者飲水進(jìn)行大規(guī)模免疫；NDV可以在組織和器官中復(fù)制，這些組織和器官也是A?V復(fù)制的地方，只需較少的抗原量就能提供較好的免疫力。中國使用NDV（LaSota）載體疫苗防控H5N1 HPA?，墨西哥用其防控H5N2 LPA?。NDV載體疫苗也存在一定的缺點(diǎn)，如針對(duì)載體的母源抗體將干擾主動(dòng)免疫的發(fā)展，限制了其大規(guī)模使用。

1.2.3rFPV載體疫苗。在19世紀(jì)80年代后期，首次報(bào)道了用于A?V的FPV載體疫苗。FPV疫苗在美國已經(jīng)獲得許可，但沒有臨床使用，而中國已經(jīng)用于H5N1 HPA?的防控。1995年以來，墨西哥也用其防控H5N2 HPA?和LPA?。rFPV疫苗也存在一些潛在的缺點(diǎn)，如果禽已經(jīng)感染過或以前免疫過該載體，則可能難以產(chǎn)生足夠的免疫力。

1.2.4r?LTV載體疫苗。研究人員對(duì)?LTV作為A?V疫苗載體的可行性進(jìn)行了試驗(yàn)。?LTV可以通過點(diǎn)眼接種，適用大規(guī)模免疫；病毒在呼吸道黏膜復(fù)制，因此可以在A?V復(fù)制的組織提供免疫力。試驗(yàn)證明，表達(dá)第1分支H5N1 HPA?V的弱毒?LTV載體，一次免疫后不但可以保護(hù)同源病毒的攻擊，還可獲得對(duì)第2.2分支的病毒（96.1%氨基酸同源性）和經(jīng)典譜系的H5 HPA?V（93.6%氨基酸同源性）的保護(hù)［1］。目前，還沒有?LTV載體疫苗獲得批準(zhǔn)。

1.2.5rAd載體疫苗。Pose等［2］利用腺病毒載體生產(chǎn)了亞單位疫苗，在雞上評(píng)估了與礦物油或雞CD154分子佐劑制備的亞單位疫苗的免疫應(yīng)答。皮下接種腺病毒載體疫苗，用106ELD50同源病毒攻毒，可以保護(hù)100%的雞不死亡。Toro等［3-4］將經(jīng)典譜系H5病毒的HA插入到腺病毒載體，雞胚內(nèi)接種后，用105E?D50的第2.2分支H5N1攻毒（與疫苗氨基酸同源性為89%），只有68%的存活率。用H5N2病毒攻毒（與疫苗毒氨基酸同源性為94%），存活率為100%，表明更密切相關(guān)的疫苗可以提供更好的保護(hù)。進(jìn)一步的研究證明，雞胚內(nèi)接種更高劑量的腺病毒載體疫苗或通過密碼子優(yōu)化疫苗構(gòu)建，都可以提高抗體反應(yīng)。

1.2.6沙門氏菌載體疫苗。Liljebjelke等［5］將第2.2分支H5N1的HA插入到沙門氏菌載體，在雞上評(píng)估高、低不同劑量同源病毒以及經(jīng)典譜系H5病毒攻毒的效果。間隔1周，口服免疫2次，用104E?D50同源病毒攻毒，雞不死亡，用106E?D50病毒攻毒，兩個(gè)免疫組的死亡率分別為60%和100%。間隔一周，免疫4次，用經(jīng)典譜系的病毒攻毒也得到了類似劑量依賴結(jié)果。

1.3減毒活疫苗

在人流感免疫方面，已經(jīng)開發(fā)和使用了流感減毒活疫苗（LAV），其潛在的優(yōu)勢是可以大規(guī)模應(yīng)用，因?yàn)槠淇梢栽谙嚓P(guān)組織中復(fù)制，產(chǎn)生更好的免疫力，包括誘導(dǎo)針對(duì)流感的細(xì)胞免疫。Steel等［6］開發(fā)了一個(gè)LAV重組A?V，同時(shí)表達(dá)NDV HN基因。雞2周齡時(shí)免疫或雞胚內(nèi)18天時(shí)接種，H5N1 HPA?V和NDV攻毒后都能獲得保護(hù)，而且雞胚內(nèi)接種比2周齡時(shí)接種可以獲得更好的保護(hù)。Nang等［7］以H9N2 LPA?V為骨架，將第1分支H5N1病毒的HA蛋白裂解位點(diǎn)突變成LP序列，構(gòu)建了冷適用病毒，同源病毒攻毒后可以保護(hù)雞不死亡，而且兩次免疫比一次免疫保護(hù)效果更好。

2　影響疫苗免疫效果的因素

在特定物種體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)研究可以獲得A?V分離株疫苗效率最可靠的數(shù)據(jù)。通常的做法是基于針對(duì)攻毒病毒的抗體來推斷保護(hù)效果，然而抗體滴度（最常用H?試驗(yàn)）與產(chǎn)生保護(hù)的數(shù)據(jù)相關(guān)性并不確定。

2.1免疫持續(xù)期

免疫持續(xù)期是疫苗免疫的一個(gè)關(guān)鍵因素。然而，由于評(píng)估免疫持續(xù)期的研究比較困難，相應(yīng)的報(bào)道也相對(duì)較少，而且結(jié)果也不統(tǒng)一，因此難以比較不同實(shí)驗(yàn)之間的結(jié)果。例如，Hwang等［8］用特定劑量的抗原（至少1.25 μg/劑量）與油佐劑制備滅活疫苗免疫雞后，用5×104E?D50同源病毒攻毒，保護(hù)期可達(dá)12個(gè)周。但要獲得對(duì)不同分支病毒的保護(hù)，則需要4倍的抗原量。Sasaki等［9］在雞上評(píng)估了不同佐劑制備的疫苗，用102LD50H5N1 HPA?V進(jìn)行攻毒，保護(hù)期可長達(dá)138個(gè)周。Boltz等［10］用商品化的H5油乳劑滅活疫苗免疫臨床雞和鴨，1個(gè)月后只有20%的禽能檢測到血凝抑制抗體。間隔8周后，再免疫2倍劑量的疫苗，10個(gè)月后仍能檢測到抗體，但5個(gè)月后效價(jià)大幅下降。

2.2疫苗的抗原匹配性

疫苗的HA與野毒的HA的匹配性被認(rèn)為是A型流感疫苗在所有物種長期有效的最重要因素。與人類流感病毒一樣，A?V有比較強(qiáng)的變異傾向。至于病毒變異到何種程度，疫苗就不能起到足夠的保護(hù)效果，目前還沒有定論。因?yàn)槟壳皼]有準(zhǔn)確的體外試驗(yàn)證明病毒漂移到某一個(gè)點(diǎn)時(shí)，抗原會(huì)發(fā)生足夠大的變異，導(dǎo)致疫苗保護(hù)效果顯著下降。

2.2.1鑒別抗原匹配性。A?V抗原漂移使得流感免疫變得復(fù)雜，首選和最常見的解決辦法是用與臨床流行毒株關(guān)系密切的種子株生產(chǎn)疫苗。比如，人類流感疫苗的生產(chǎn)需要經(jīng)常更新疫苗種子株，每年世界衛(wèi)生組織（WHO）專家組會(huì)預(yù)測哪個(gè)抗原變異株會(huì)占優(yōu)勢，并決定使用哪個(gè)病毒株來生產(chǎn)疫苗。對(duì)于獸用疫苗，類似方法也是有益的，但是實(shí)施困難較大。對(duì)于A?V，免疫攻毒試驗(yàn)是鑒定種子株與攻毒株之間抗原匹配性的最好方法。潛在種子株的選擇最初是通過體內(nèi)試驗(yàn)利用H?或病毒中和（VN）試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析不同分離株之間的抗原相關(guān)性［6］，然而這種方法難以對(duì)大量的毒株進(jìn)行驗(yàn)證。另一種方法是利用HA氨基酸序列分析以確定與攻毒毒株序列最接近的毒株。但是由于并不是所有氨基酸變化都是重要的抗原位點(diǎn)，所以比較氨基酸同源性的預(yù)測價(jià)值有限，這種方法對(duì)于預(yù)測保護(hù)準(zhǔn)確性較差（圖1）。相比而言，繪制抗原圖譜的方法則更為準(zhǔn)確，因?yàn)樗Y(jié)合了如H?或VN試驗(yàn)等血清學(xué)的結(jié)果，可以鑒定潛在的疫苗株。

2.2.2誘導(dǎo)交叉免疫反應(yīng)。“通用”疫苗可以誘導(dǎo)針對(duì)同一亞型或不同亞型的交叉免疫應(yīng)答，是針對(duì)抗原變異較大流感免疫的一個(gè)有效方法。在眾多候選表位中，廣譜保護(hù)性疫苗最經(jīng)常使用的是M2蛋白的外部域（M2e）。Layton等［11］在雞上評(píng)估了表達(dá)M2e保守表位和雞CD154的重組減毒沙門氏菌作為疫苗的可行性。該疫苗不僅能誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，而且在用H7N2 LPA?V攻毒后可以保護(hù)雞不發(fā)病，但不能提供針對(duì)H5N1 HPA?V的任何保護(hù)，表明該系統(tǒng)雖然還存在一定的問題，但具有潛在的可行性。基于M2e疫苗在小鼠模型的進(jìn)一步研究表明，其對(duì)變異抗原的交叉保護(hù)有美好的前景。例如，合成的M2e肽與弗氏不完全佐劑免疫小鼠后3次，可以保護(hù)小鼠抵抗10 LD50第1分支和第2.3.4分支H5N1 HPA?V的攻擊。將M2e表位插入到表達(dá)HA的重組腺病毒載體疫苗，可以提高交叉反應(yīng)性［12］。除M2e之外，HA莖部域（HA2域）是另一個(gè)潛在的“通用”中和表位，可以誘導(dǎo)針對(duì)A?V更廣泛的免疫［13-14］。

圖1 疫苗毒株與攻毒毒株之間氨基酸同源性與死亡率之間的關(guān)系

2.3疫苗生產(chǎn)

提高病毒在雞胚中的復(fù)制是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。最近，一些新的技術(shù)在疫苗研究領(lǐng)域得到應(yīng)用，如利用反向遺傳技術(shù)，將H5 HA修飾為包含LP的裂解位點(diǎn)，它們復(fù)制良好，可以獲得比較高的病毒滴度，而且不需要擔(dān)心疫苗中使用高致病性病毒的生物安全問題。另一個(gè)策略是開發(fā)替代平臺(tái)，生產(chǎn)非傳染性疫苗抗原。DNA疫苗和桿狀病毒等系統(tǒng)表達(dá)疫苗是兩種最常用的亞單位疫苗。DNA疫苗的成本較高，而且需要對(duì)每個(gè)動(dòng)物接種，如果沒有技術(shù)上的很大改進(jìn)，在家禽中的應(yīng)用價(jià)值不大。后者則是利用了桿狀病毒等系統(tǒng)表達(dá)插入了的流感病毒HA基因。Swayne等［15］在雞上評(píng)估了桿狀病毒表達(dá)H5 HA蛋白的亞單位疫苗，在接種一次后，用同源H5N1 HPA?V攻毒，死亡率、發(fā)病率和排毒均減少。

2.4佐劑

好的佐劑能提高抗體滴度、免疫持續(xù)時(shí)間，甚至免疫力的廣度。由于目前使用的礦物油佐劑便宜而且效果很好，所以滅活A(yù)?V疫苗中的礦物油替代品較少。

墨西哥和中國使用NDV活載體疫苗防控A?，有研究者評(píng)估了殼聚糖和脂質(zhì)體在NDV活疫苗刺激黏膜免疫的佐劑作用。

2.5母源抗體干擾

母源抗體對(duì)幼禽免疫接種的干擾問題一直存在。對(duì)免疫種禽的后代和7日齡雛雞被動(dòng)免疫接種的試驗(yàn)表明，母源抗體可以干擾免疫A?V接種［16］。目前，對(duì)于H5N1的防控，沒有特定的策略能在家禽孵化期消除母源抗體干擾，但是用于其他家禽疾病的載體疫苗，如HVT和FPV疫苗，有很多優(yōu)點(diǎn)可以克服母源抗體干擾的問題。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

The Reach Progress on H5N1 Avian Inf uenza Vaccines and Analysis on the Factors Inf uencing Its Immune Effects

Jiang Wenming，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Vaccination has played an important role in the prevention and control of H5N1 highly pathogenic avian influenza （HPA?）. However there are many factors influencing the vaccine efficiency，and further improvement is needed. ?n this paper，we reviewed the current situation and progress on H5N1 avian influenza vaccines and the factors that influence the vaccine efficiency，including immune duration，antigenic matching，vaccine production，adjuvants and maternal antibody interference.

avian influenza virus；H5N1；vaccine；vaccination；research progress；influence factors

S852.65

C

1005-944X（2015）11-0061-05

青島市科技計(jì)劃14-2-4-105-jch

陳繼明