梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）竹稈水溶性多糖的分離提取及結構分析

姚　曦，岳永德，湯　鋒（國際竹藤中心，北京100102）

梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）竹稈水溶性多糖的分離提取及結構分析

姚曦，岳永德，湯鋒*
（國際竹藤中心，北京100102）

采用高效離子色譜法、凝膠色譜法分析了梁山慈竹竹稈多糖組成及分子量分布，結合傅立葉紅外光譜、核磁波譜和熱穩定性分析探討了該多糖結構及性質。結果表明：水解后竹稈多糖組成是葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和甘露糖，相對含量分別為40.57%、21.88%、19.89%、17.5%和0.15%。多糖的重均相對分子量Mw為16900 u，多分散性系數D（Mw/Mn）為1.33。該多糖具有典型多糖特征吸收峰，為吡喃型酸性多糖。熱穩定性分析表明BCP在240℃開始發生降解，500℃基本結束。

梁山慈竹，竹稈，多糖，結構分析

現代研究表明，竹提取物具有良好的抗菌、抗氧化、抗衰老等功效，竹類資源的研究和利用正方興未艾。在眾多活性組分中，竹多糖是竹子中除黃酮類物質外一類重要地具有較好生物活性的大分子物質。從20世紀60年代起日本有學者就對竹葉多糖開展了相關研究，證實了竹葉多糖藥用功效［1］。近年來，研究者們在竹多糖的提取分離［2-5］、多糖純化［6-7］、組分分析［8-9］等方面取得了不少進展，在生物活性方面，竹多糖在增強機體免疫功能及抗腫瘤作用［10-11］、抗氧化功效［12-13］、抗疲勞作用［14］、降血糖作用［15］、保肝護肝［16］等方面也顯示出良好的活性。在其他類植物多糖結構研究中應用較多的紅外光譜（IR）［17］、核磁共振波譜（NMR）［18］等技術手段未見在竹葉多糖研究中有應用報道，關于竹多糖的結構分析仍處于空白，這也是與其他植物性多糖研究差距較大的地方。因此本文以梁山慈竹竹稈多糖（Bamboo culm polysacchride，BCP）為原料，分析其多糖組成、相對分子量及分布情況，結合紅外光譜（FT-IR）和核磁共振（NMR）等手段對其進行結構表征，并考察BCP的熱穩定性，為加強竹多糖的基礎研究以及產品開發提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

梁山慈竹（D.farinosus）竹稈樣品于2010年5月采自于四川宜賓世紀竹種園。將采集的竹材，自然條件下于通風處室內陰干。將各竹稈切成約3 cm×2 cm長小塊，用電動粉碎機加工成粉末，過60目篩，收集備用；單糖對照品（L-阿拉伯糖、L-葡萄糖、L-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖）美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

BP-221S電子天平（d=0.1 mg）德國Sartorius公司；EYELAN-1000旋轉蒸發儀日本EYELA公司；LABCONCO Free Zone冷凍干燥儀美國LABCONCO公司；ICS3000高離子色譜儀配備脈沖安培檢測器（PAD）及糖分析專用離子交換分析柱（PA-1，4× 250 mm），美國Dionex公司；Q500熱重分析儀美國TA公司；Nexus傅立葉紅外光譜儀美國Nicolet公司；Bruker AV300核磁共振波譜儀德國Bruker公司。

1.2實驗方法

1.2.1竹稈多糖制備

1.2.1.1竹稈多糖的提取準確稱取10 g竹稈粉末于具塞三角瓶中，以料液比1∶25，加入250 mL蒸餾水，于80℃下攪拌3 h。浸提液抽濾后濃縮濾液至100 mL。用80%乙醇沉淀過夜，4倍體積的Sevag試劑除蛋白，搖勻后以5000 r/min轉速離心5 min，將沉淀凍干即得到竹稈多糖BCP。

1.2.1.2竹稈多糖的水解［19］取0.005 g多糖固體于棕色小瓶中，加入0.125 mL 72%H2SO4，1.35 mL超純水；置于105℃烘箱中2.5 h（每30 min搖晃一次）。冷卻，將樣品溶液稀釋50倍后，過0.22 μm親水性濾頭，濾除不溶物，再取1.5 mL于進樣瓶中，待分析。

1.2.2分子量測定BCP的分子量測定采用高效凝膠色譜法（HPGPC）［20］。具體分析條件如下：Aguagel-OH（300 mm×7.5 mm，8 μm）色譜柱，示差檢測器（RID），淋洗液為含有0.02 mol/L氯化鈉的5 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH為7.5，流速為0.5 mL/min，溫度為30℃，樣品濃度為0.1%，以已知分子量多糖標準品的保留時間做標準曲線來計算多糖樣品的分子量水平。

1.2.3單糖組成分析采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）［21］分析。淋洗液濃度為18 mmol/L NaOH并柱后加堿0.3 mol/L NaOH，流速為0.5 mL/min，分析時間為45 min，然后用0.2 mol/L NaOH沖洗色譜柱10 min，再用18 mmol/L NaOH以相同流速平衡色譜柱10 min。得到的色譜圖與標準單糖的保留時間進行定性，外標法計算糖含量。

1.2.4紅外光譜（FT-IR）分析［22］將BCP樣品以1∶100比例同溴化鉀混合后，在瑪瑙研缽中磨至約200目粉末，在紅外壓片機上制成透明薄片，采用紅外光譜儀配備DTGS（氘化硫三肽）熱電檢測器分析。掃描波長范圍為4000～400 cm-1，共掃描64次，分辨率為2 cm-1。以純溴化鉀得到的紅外光譜圖作為背景。

1.2.5核磁共振波譜（NMR）分析［23］BCP樣品用1 mL重水（D2O）溶解后在核磁共振儀上進行1H-NMR和13C-NMR分析，以四甲基硅烷（TMS）為內標物。核磁條件為氫譜（1H-NMR）：脈沖程序（PULPROG）：zg；馳豫延遲（D1）：2.00000000 sec；采樣通道1H高功率90°脈寬（P1）：4.00 usec。碳譜（13C-NMR）：脈沖程序（PULPROG）：zgdc；馳豫延遲（D1）：2.00000000 sec；采樣通道1H高功率90°脈寬（P1）：3.00 usec。

1.2.6熱穩定性分析［22］BCP樣品的熱重（TGA）分析采用同步熱分析儀測定。將10 mg樣品置于鋁坩鍋中，在氮氣的環境下，以10℃/min的加熱速度從室溫加熱到600℃，連續記錄樣品的質量變化和放熱數據而獲得樣品的熱穩定性數據。

2　結果與分析

2.1得率及性狀

經醇沉、離心冷凍干燥后，最終得到粗多糖98 mg，即梁山慈竹BCP含量為9.8 mg/g。其基本性狀為：深紅褐色，易溶于水、酸、堿等無機溶液；難溶于無水乙醇、丙酮等有機溶劑。其溶液呈中性，pH=7.0。

2.2分子量大小及分布

多糖樣品的分子量由凝膠色譜儀在水相中測定。由結果知BCP樣品的重均相對分子量Mw為16900 u，數均相對分子量Mn為12700 u，峰位分子量Mp為5503.5 u，多分散度D（Mw/Mn）為1.33。

圖1　梁山慈竹BCP的分子量分布圖Fig.1　Molecular weights distribution curves of D.farinosus’culm polysaccharides

2.3單糖組成分析

圖2HPGPC分析圖譜Fig.2　HPGPC analysis

圖2（a）為5種單糖標準品色譜圖，圖2（b）為梁山慈竹BCP水解后離子色譜圖。根據相應單糖標準樣品的相對保留時間進行定性，根據面積歸一化法計算各種單糖的含量占樣品中總多糖量的百分比來定量，峰面積之比=質量比。由圖2可知，梁山慈竹竹稈水溶性多糖由5種主要單糖組成的雜多糖，依次為阿拉伯糖（Ara）21.88%、半乳糖（Gal）17.5%、葡萄糖（Glu）40.57%、木糖（Xyl）19.89%以及極少量的甘露糖（Man）0.15%。

2.4紅外光譜（FT-IR）分析

圖3　梁山慈竹BCP的紅外光譜圖Fig.3　Infrared spectrum of D.farinosus’s polysaccharides

從紅外光譜圖上看（圖3），BCP組分中含有的結構和基團及其特征吸收有：3423.5 cm-1處出現一個寬峰，是多糖羥基（O-H）的伸縮振動峰，表明多糖存在分子內的氫鍵；2929.0 cm-1處為一個弱的糖類亞甲基（C-H）的伸縮振動峰，也是糖類的特征峰；2361.3 cm-1處所形成的峰可能為結晶水結構形成的峰；1646.5 cm-1和1079.9 cm-1處的吸收峰則說明有羧酸的存在，可能為C=O的非對稱伸縮振動；1419.1 cm-1和1325.1 cm-1處是由多糖C-H的變角振動引起的；1200～1100 cm-1的吸收峰為吡喃糖特征吸收峰，醚鍵（C-O-C）和羥基的吸收峰；1024.9 cm-1處的強吸收則是葡萄糖的特征吸收。950～1250 cm-1有強吸收峰，說明多糖組成是吡喃型，且含羧基，證明為酸性多糖。在460～670 cm-1間有一特征峰為對稱環伸縮振動引起的。1700～1750 cm-1處沒有特征吸收峰的存在證明樣品中不含糖醛酸。紅外光譜未見1616 cm-1的-NH2和-NH3的特征吸收峰，說明了不含蛋白多糖。在（817±70）cm-1處無吸收峰，表明不含酮糖［23］。

表1　梁山慈竹BCP的紅外光譜解析Table 1　Results of IR absorption spectrum of polysaccharide

2.5核磁共振波譜分析

在BCP組分的13C核磁共振譜圖如圖4所示。從其碳譜可以看出，五個主信號δ102.08（C-1），δ75.98（C-4）、δ74.52（C-3）、δ73.06（C-2）和δ63.21 ppm（C-5）來自（1→4）木聚糖主鏈上的吡喃木糖基單元，另外一些較弱的信號δ86.37 ppm、δ78.40 ppm、δ73.48 ppm、δ72.25 ppm、δ59.68 ppm來源于阿拉伯糖單元。

圖4　梁山慈竹BCP的13C NMR譜圖Fig.4　13C NMR spectra of D.farinosus’s polysaccharides

δ18 ppm附近未出現碳信號，說明該多糖中不含鼠李糖，與2.3中單糖組成分析一致。1HNMR譜可用于確定多糖中糖殘基的糖苷鍵構型。一般來說，呋喃型阿拉伯糖單元特征峰在δ5.2～5.4 ppm區間出現，而吡喃型木糖單元特征峰在δ4.4～4.7 ppm出現。BCP組分的1H核磁共振譜圖被記錄并顯示如圖5所示。在δ5.1有一較弱信號，而在C1上的質子H1的強吸收峰在δ4.61，說明竹稈多糖符合吡喃型木糖單元特征，也與紅外分析結果一致。主要信號分別為δ4.15、δ3.79、δ3.48、δ3.22、δ3.09、δ3.00 ppm來自未取代的（1→4）-β-D-木糖單元。

圖5　梁山慈竹BCP的1H NMR譜圖Fig.5　1H NMR spectra of D.farinosus’s polysaccharides

2.6熱穩定性分析

研究表明，大部分植物多糖在220℃左右開始降解，最快降解速度多發生260～320℃之間。從熱重分析曲線上可以看出（圖6），降解過程主要分為4個階段：從室溫到240℃的第一階段，共失重約5%，可能是水分或其他易揮發物的損失；第二階段是大分子聚合物的降解，在240～340℃溫度區間，積分結果顯示，梁山慈竹BCP在274℃前后降解速度最快，此階段BCP的質量損失大約為65%；第三階段當溫度達到500℃時，BCP的質量緩慢地損失至73%；此后隨著溫度的升高，BCP樣品最終成了碳化結構。

圖6　梁山慈竹BCP的熱重分析曲線Fig.6　The TGA curves of the polysaccharide isolated from the D.farinosus

3　結論

高效離子色譜法（HPIC）測定了梁山慈竹竹稈多糖中各單糖的種類及構成比例，該多糖中葡萄糖含量最高（相對含量為40.57%），其次是由阿拉伯糖、木糖、半乳糖和甘露糖（21.88%、19.89%、17.5%和0.15%）等5種單糖組成。高效凝膠色譜法（HPGPC）測定出純化后的該多糖的重均相對分子量Mw為16900 u，多分散度D（Mw/Mn）為1.33，多分散度越接近1，表明該多糖的高聚物分子量分布范圍較窄，純度較高［24］。紅外光譜和核磁波譜鑒定表明其具有多糖的特征吸收峰，并具有吡喃型酸性多糖特征。熱穩定性分析表明該多糖在240℃開始發生降解，500℃基本結束。上述結果為竹多糖的進一步深入研究奠定基礎。

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Extraction and structure analysis on polysaccharide of Dendrocalamus farinosus culm

YAO Xi，YUE Yong-de，TANG Feng*
（International Centre for Bamboo and Rattan，Beijing 100102，China）

The polysacchride was extracted from Dendrocalamus farinosus culms with hot water，and precipitated by ethanol.The polysacchride was composed of glucose，arabinose，xylose，galactose and mannose with the contents of 40.57%，21.88%，19.89%，17.5%and 0.15%respectively by high performance ion chromatography（HPIC）.The average molecular weights（Mw）of the polysacchride was 16900 u and the polydispersity was 1.33. Infrared spectrogram showed that the polysacchride had the characteristic absorption peak of polysaccharides.1HNMR and13CNMR indicated that its main chains were composed of β-pyranglycoside linkage.Thermal analysis showed that the polysacchride fraction began to degrade at 240℃ and the degradation ended at 500℃.

Dendrocalamus farinosus；bamboo culm；polysaccharides；structural analysis

TS207.3

A

1002-0306（2015）20-0120-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.016

2015－03－09

姚曦（1981-），男，博士，助理研究員，研究方向：植物化學、食品分析，E-mail：yaoxi@icbr.ac.cn。

湯鋒（1969-），男，博士，教授，研究方向：植物化學、生物農藥，E-mail：fengtang@icbr.ac.cn。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD23B03）。