廣西壯族人群IL-12基因的單核苷酸多態性研究

陸潞，謝克恭，韋貴將，王俊利，陸敏安，喬寧寧，盧賢哲，唐毓金

細胞與分子生物學

廣西壯族人群IL-12基因的單核苷酸多態性研究

陸潞，謝克恭，韋貴將，王俊利，陸敏安，喬寧寧，盧賢哲，唐毓金△

目的分析白細胞介素（IL）-12A基因單核苷酸多態性（SNP）位點rs568408和IL-12B基因SNP位點rs3212227的各基因型和等位基因在廣西壯族人群中的分布頻率，及不同地區的分布差異。方法采用單堿基延伸的PCR技術對165例廣西壯族人群IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227進行多態性檢測，對比國際人類基因組計劃（HapMap）公布的中國北京、日本、非洲和意大利人群的SNP分型數據，分析5個人群rs568408、rs3212227位點的基因型和等位基因頻率差異。結果在廣西壯族人群中存在rs568408和rs3212227多態性，2位點基因型及等位基因頻率在男女性別間差異無統計學意義（P＞0.05），IL-12A rs568408與北京、日本和意大利人群差異無統計學意義（P＞0.05），但與非洲人群存在差異（P＜0.01）；IL-12B rs3212227與北京和日本人群差異無統計學意義，但與非洲和意大利人群存在差異（P＜0.01）。結論IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227存在多態性，2位點基因型和等位基因在廣西壯族人群中的分布頻率與其他種族和地區人群相比存在差異，這種差異可能是導致某些疾病在不同人群發病率和臨床表現存在差異的原因之一。

白細胞介素12；多態性，單核苷酸；廣西［壯族自治區］；人種群

白細胞介素12（interleukin12，IL-12）是一種具有多種生物活性的異戊二聚體細胞因子，由p35和p40 2個亞基經二硫鍵連接形成，亞基分別由位于染色體3p12～q13.2的IL-12A基因和位于染色體5q31～33的IL-12B基因編碼［1］。研究發現，IL-12A基因與IL-12B基因存在多個功能性多態性位點，且這些多態性位點可能影響惡性腫瘤［2］、自身免疫性疾病［3］、結核?。?-5］等疾病的發生和發展進程。因此，準確分析IL-12基因多態性在不同地區和不同人群中的分布，可以為基因多態性與某些疾病發生發展的關系提供更多有力的研究依據。本文采用SNaP?shot SNP分型技術檢測165例廣西壯族人群IL-12A基因rs568408位點和IL-12B基因rs3212227位點的遺傳多態性，為與IL-12相關的遺傳和疾病等方面的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年10月—2013年10月到廣西右江民族醫學院附屬醫院進行健康體檢的165例體檢健康者作為考察對象。籍貫均為廣西，無可查親緣關系，向上追溯3代均為壯族人群，且長期在廣西居住。其中，男97例，女68例，年齡18～71歲，平均（39.53±14.39）歲；各項臨床及實驗室檢查指標均正常。

1.2 基因組DNA的提取清晨抽取健康體檢者肘正中靜脈血2 mL，用EDTA-K2抗凝；采用已建立的改良碘化鈉法提取白細胞基因組DNA，-80℃冰箱保存備用。

1.3 聚合酶鏈反應（PCR）根據NCBI上查找的IL-12A、IL-12B基因DNA序列，選擇包含rs568408位點和rs3212227位點的序列并輸入引物設計軟件Primer 5，得到用于特異性擴增包含rs568408位點IL-12A基因和rs3212227位點IL-12B基因的PCR上、下游引物和延伸引物。其中，rs568408位點的上游引物序列為5′-GAGGTCCCTCCAAA CCGTTGTC-3′，下游5′-CAGGATGGATATTTTCCCTTCT?TAGCA-3′，延伸引物序列為5′-ATGTCAAAAATACTTGAT?CAGAGGTAT-3′。rs3212227位點的上游引物序列為5′-GGCAACTTGAGAGCTGGAAAATCT-3′，下游：5′-TCCAG?GATGAAAATTTGGAGGAAAA-3′，延伸引物序列為5′-TTT TTTTTTGATATCTTTGCTGTATTTGTATAGTT-3′。PCR擴增反應體系共20μL，其中包括：10×PCR反應緩沖液2.0μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，基因組DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補足至20μL。PCR反應條件：94℃，15 min；94℃×30 s，60℃× 30 s，72℃×20 s，共35個循環；72℃×10 min。PCR產物使用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，4℃保存。

1.4 SNaPshot SNP分型技術PCR產物經蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用蝦堿酶純化后在ABI3130XL上樣。SNP分型用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）分析。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。根據測序結果直接計算廣西壯族人群2個位點的基因型和等位基因頻率，Hardy-Weinberg遺傳平衡采用χ2檢驗。登錄NCBI查找HapMap公布的4個人群（北京人群、日本人群、非洲人群和意大利人群）2位點的分型結果，該人群與廣西壯族人群的基因型和等位基因頻率差異比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計意義。

2 結果

2.1 IL-12A rs568408和IL-12B rs3212227的檢測結果包含IL-12A rs568408位點和IL-12B rs3212227位點的PCR擴增產物片段分別為210 bp和217 bp。ABI 3130XL的SNP分型結果顯示，rs568408位點的基因型有3種，分別為AA、AG和GG，基因分型結果見圖1。rs3212227位點的基因型有3種，分別為TT、TG和GG，因其為反向測序，反轉后分別對應的基因型為AA、AC、CC，基因分型結果見圖2。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測結果顯示所選人群群體代表性好（均P＞0.05），可以反映廣西地區壯族人群的總體情況，見表1。

Fig.1IL-12A gene rs568408 genotyping圖1 IL-12A基因rs568408位點SNP分型結果

Fig.2IL-12B gene rs3212227 genotyping圖2 IL-12B基因rs3212227位點SNP分型結果

2.2 IL-12基因多態性在廣西壯族人群中的分布廣西壯族人群中，rs568408位點的GG基因型最常見，為77.0%；G等位基因型的頻率最高，為87.6%。rs3212227位點的AC基因型最常見，為43.6%；A等位基因型的頻率最高，為50.3%。兩位點基因型及等位基因頻率男女組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2、3。

Tab.1Hardy-Weinberg equilibrium test results of the IL-12A gene rs568408A/G genotype and the IL-12B gene rs3212227 genotype in Zhuang populations in Guangxi表1 廣西壯族人群IL-12A rs568408A/G基因型和IL-12B rs3212227A/C基因型Hardy-Weinberg平衡檢測結果

Tab.2Genotype distribution and allele frequency of IL-12A gene rs568408 in Zhuang populations in Guangxi表2 IL-12A基因rs568408位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布例（%）

2.3 IL-12基因多態性與其他人群的比較廣西壯族人群IL-12A rs568408基因型和等位基因頻率與北京、日本和意大利人群比較差異無統計學意義（P＞0.05），但與非洲人群存在差異（P＜0.01），見表4。IL-12B rs3212227基因型和等位基因頻率與北京和日本人群比較差異無統計學意義（P＞0.05），但與意大利和非洲人群存在差異（P＜0.01），見表5。

Tab.3Genotype distribution and allele frequency of IL-12B gene rs3212227 in Zhuang populations in Guangxi表3 IL-12B基因rs3212227位點基因型及等位基因頻率在廣西壯族人群的分布例（%）

Tab.4Genotype and allele distribution of IL-12A gene rs568408 among different regional groups表4 不同地區人群IL-12A基因rs568408位點多態性分布頻率的比較例（%）

Tab.5Genotype and allele distribution of IL-12B gene rs3212227 among different regional groups表5 不同地區人群IL-12B基因rs3212227位點多態性分布頻率的比較例（%）

3 討論

3.1 IL-12基因的免疫調節功能IL-12基因是由一種具有多種生物學活性的炎性細胞因子，主要由抗原激活的樹突細胞（DC）、單核/巨噬細胞和B細胞等抗原提呈細胞（APC）產生［6］。IL-12在抗腫瘤及抗結核的免疫調節中發揮重要作用。IL-12能誘導T細胞和自然殺傷（NK）細胞釋放干擾素γ（IFN-γ）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）破壞腫瘤內血管的生成，并激活P35途徑促使腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤的進展［7］。研究發現，腫瘤抗原的致敏和基因修飾可促使小鼠DC分泌的IL-12和IFN-γ呈高表達［8］。在抗結核免疫中，能通過誘導CD4+T細胞向Th1細胞分化，促進單核巨噬細胞產生IFN-γ以及增加CD8+T細胞和NK細胞的細胞毒活性等方式參與機體對結核病的免疫應答［9］。

3.2 IL-12基因多態性與疾病在探討IL-12與疾病相關性的過程中，國內外學者發現，IL-12A、IL-12B基因存在多種功能性多態性位點，基因的多態性影響體內IL-12的轉錄和表達，可能對疾病的發生和進展產生影響。Wang等［2］通過對106例骨肉瘤患者和210例健康人的IL-12A、IL-12B基因多態性檢測發現，病例組rs568408位點GA、GA/AA基因型和rs3212227位點CC、AC/CC基因型顯著高于對照組，且IL-12B rs3212227位點的基因多態性下調體內IL-12p40水平，IL-12基因多態性與骨肉瘤的易感性相關。Wong等［3］研究發現IL-12B rs3212227位點的基因多態性與強直性脊柱炎的發病風險具有相關性，該研究中，攜帶CC和AC基因型的人患強直性脊柱炎的風險分別是攜帶AA基因型的人的1.93倍和1.73倍，同時，IL-12B基因與IL-23R基因的交互作用影響著強直性脊柱炎的進展和嚴重程度。Peresi等［4］在巴西的研究發現來自IL-12B基因rs3212227 G/T位點的SNP能影響IL-12p40的表達水平，導致機體對結核分枝桿菌易感。Wang等［5］研究發現IL-12A基因的多態性可能與中國人肺結核的易感性有關，IL-12基因和IFNG基因的多態性可能單獨或者協同影響肺結核遺傳易感性及其預后。因此，準確分析IL-12A、IL-12B基因多態性在不同人群中的分布，可以為不同IL-12相關疾病的發生發展提供更多有力的證據。

3.3 廣西壯族人群2位點基因多態性分布與其他人群的差異本研究顯示，在廣西壯族人群中，rs568408和rs3212227 2個位點基因型和等位基因頻率男女性別間差異無統計學意義，說明2位點基因型分布可能與性別無關，對比HapMap上4個人群的SNP分型數據，2位點廣西壯族人群的基因型和等位基因頻率與親緣關系相對較近同為黃種人的北京和日本人群比較差異無統計學意義，但是與親緣關系相對較遠的非洲黑種人相比存在差異。表明此2位點基因型分布可能與種族有密切關系，符合“親緣關系越近，其基因型分布越相似，反之，則差異顯著”的遺傳學規律。在rs568408位點，廣西壯族人群的基因型及等位基因頻率與意大利人比較差異無統計學意義，而在rs3212227位點存在差異，則說明了在種族進化中的明顯異質性，而這種遺傳異質性以及基因多態性的差異，很可能是導致某些疾病在不同地區不同人群中發病率和臨床表現存在差異的原因之一。

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（2014-10-21收稿2015-01-13修回）

（本文編輯李鵬）

Single nucleotide polymorphisms of IL-12 gene in Zhuang populations in Guangxi

LU Lu，XIE Kegong，WEI Guijiang，WANG Junli，LU Min'an，QIAO Ningning，LU Xianzhe，TANG Yujin△
Department of Spinal Orthopedic Surgery，First Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise Guangxi 533000，China△

ObjectiveTo investigate the frequencies of genotype and allele distribution of IL-12A gene single nucleo?tide polymorphisms（SNP）rs568408 and IL-12B gene SNP rs3212227 in Zhuang populations in Guangxi，and to compare the distribution of IL-12A and IL-12B polymorphisms among different races.MethodsThe IL-12A SNP rs568408 and IL-12B SNP rs3212227 were detected by SNaPshot SNP genotyping technique in 165 Zhuang people in Guangxi，frequen?cies of genotype and allele of IL-12A gene rs568408 and IL-12B rs3212227 polymorphisms were analyzed in Zhuang popu?lations compared with the other four populations（HapMap-HCB，HapMap-JPT，HapMap-YRI，HapMap-TSI）from Hap?Map database.ResultsThere were polimorphisms of IL-12A and IL-12B gene in Zhuang populations in Guangxi.The fre?quencies of allele and genotype distribution of IL-12A gene rs568408 polymorphisms were not significantly differenct com?pared with HapMap-HCB，HapMap-JPT and HapMap-TSI（P＞0.05），but were significantly different compared with Hap?Map-YRI（P＜0.01）；The frequencies of allele and genotype distribution of IL-12B rs3212227 polymorphisms were not sig?nificantly differenct compared with HapMap-HCB and HapMap-JPT（P＞0.05），but were significantly different compared with HapMap-YRI and HapMap-TSI（P＜0.01）.ConclusionThere are significant differences in the frequencies of allele and genotype distribution of IL-12A gene rs568408 and IL-12B gene rs3212227 between Zhuang populations and other eth?nic populations，and this variation might contribute to a variety of clinical manifestation and morbidity of some IL-12 related diseases.

interleukin-12；polymorphism，single nucleotide；Guangxi；ethnic group

R394.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.005

國家自然科學基金資助項目（81260315）；廣西自然科學基金項目（2012GXNSFAA053169）；廣西衛生廳醫療衛生重點科研課題項目（重2010059）；廣西衛生廳自籌經費科研課題項目（Z2012712）

廣西百色，右江民族醫學院附屬醫院脊柱外科（郵編533000）

陸潞（1981），男，碩士在讀，主要從事脊柱與骨關節疾病研究

△通訊作者E-mail：tangyujin196709@163.com