結核病血清診斷中HSP65的應用前景分析

孫麗娜+孫京濤+田永全

[摘要] 目的通過評價HSP65抗原表達在結核病血清診斷中的效果，分析其應用前景。方法取活動期結核病患者63例納入觀察組，選取體檢健康志愿者60例納入對照組，就HSP65分別與38 kDa、16 kDa、LAM聯合檢測診斷對照組與觀察組結核病。結果W estern-hlot結果顯示，表達產物在相對分子量65 kμ處有一條表達帶，在健康人血清陰性中則無表達帶；特異度、敏感度與38 kPa基本一致，差異無統計學意義（P>0.05）。結論HSP65在結核病血清診斷中可作為備選標志物，反應強度與38kDa基本相當，聯合診斷有助于提高診斷符合率；HSP65對結核病X線空洞影敏感度較高。

[關鍵詞] 結核病；結核分歧桿菌；血清學；HSP65

[中圖分類號] R69 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）04（a）-0010-002

結核病（tuherculosis，TB）是一種結核分枝桿菌感染引起的傳染病，全世界每年約有20億人感染結核分枝桿菌（M.tuherculosis，MTB），我國TB發生率、發病率、病死例均位于世界前列，TB防控形勢仍不容樂觀。MTB潛伏性是致TB防控效果不佳的主要原因之一，感染者早期常無典型癥狀表現，且難以根除，無癥狀攜帶者對MTB抗原產生遲發型超敏反應（DTH）是潛伏期診斷的唯一指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2013年2月-2014年5月該醫院收治的所有活動期結核患者作為研究對象。納入標準：①臨床確診，活動期患者；②知情同意；③臨床資料完整。入選患者63例納入觀察組，其中男33例、女30例，年齡27～ 64歲，平均（44±14）歲，病程1～8年，平均（1.5±3.2）年，抗酸染色陽性43例、痰細菌培養陽性52例、PPD皮試陽性35例，X線片結核空洞影46例。選取體檢健康志愿者60例納入對照組，其中男31例、女29例，年齡28～64歲，平均（ 45±12）歲，未合并有肺部疾病，如肺結核、肺炎，兩組患者年齡、性別差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 材料與試劑

E.coli DH5α、MTB H37Rv株，pPRO EX Hrra原核表達載體，GCG疫苗株，Takara公司提供。LA Taq DNA聚合酶、Ecor I試劑Takara公司提供，T4連接酶、質粒DNA小量提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司產），DNA快速純化/回收試劑盒，標準蛋白分子量、HRP-羊抗鼠IgH、HRP-羊抗人IgG，鼠抗MTB HSP65 mAh等。儀器主要包括：TGL.16G高速臺式離心機，HERAEYS C02培養箱，法VILBER LOURMAT公司產VILBER凝膠成像儀，SPECORD 40紫外分光光度儀，-70℃超低溫冰箱，倒置顯微鏡，生物安全臺，醫用凈化工作臺，Dy-3D型多功能電泳儀，緊密電子天平，Olymhus公司熒光顯微鏡，SUN公司酶聯免疫吸附儀等。

1.3 方法

制備E.coli DH 5α感受態細胞。參照GenBank組織標準MTB HSP65編碼，設計引物，由北京奧科生物技術有限公司提供。擴增HSP65基因，擴增產物行DNA快速純化回收。回收產物與克隆載體，將混合物以熱休克法轉化為E.coli DH5α感受態細胞，觀察白色菌落。進行重組質離酶切鑒定、序列測定，陽性克隆名為pPRO-hsp65，進行鑒定，取鑒定正確的陽性菌行IPTG誘導，誘導后行SDS-PAGE凝膠電泳分析。以Ni-NTA純化試劑盒純化蛋白，離心100 mL誘導菌液，制備樣品，進行親和色譜純化，收集洗脫液，以紫外分光光度儀測定純化蛋白濃度，將洗脫液以置于-20℃恒溫冰箱保存備用。

表達產物經SDS-PAGE凝膠電泳分析后，100 V恒壓電轉1 h行蛋白電轉，后轉至硝酸纖維素膜上、行麗春紅染色，若蛋白電轉成功，以蒸餾水洗至褪色，以10 g/L牛血清白蛋白TBST封閉30 min，連續震蕩洗滌3×5 min，分別以鼠抗MTB HSP65 mAh、觀察組患者血清、對照組健康人血清結合1 h，TBST震蕩洗滌3×5 min，加HRP標記羊抗鼠IgG結合th，TBST震蕩洗滌3×5 min，以OPD顯色液觀察結果。同時，聯合目前臨床已相對成熟的38 kDa、16 kDa、LAM抗原血清學應答輔助診斷，將觀察組與對照組患者血清編號打亂，觀察組作為“真陽性”、對照組為“假陽性”，則敏感度=觀察組中檢查出的陽性例數/真陽性例，特異度=觀察組中檢查出陰性例數/真陰性例。

1.4 統計方法

數據以SPSS 13.0軟件處理，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用X?檢驗。

2 結果

2.1 不同抗原表達血清診斷

Western-hlot結果顯示，表達產物在相對分子量65 kμ，處有一條表達帶。HSP65分別與38 kDa、16 kDa、LAM聯合檢測，敏感度、特異度均有不同程度提高，其中與38 kDa聯合檢測敏感度、特異度最高，HSP65+38 kDa敏感度高于HSP65，HSP65特異度高于16 kDa，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1

抗酸染色、PPD皮試與X線片對HSP65檢測影響

HSP65血清抗原檢測正確者X線片結核空洞影比重高于錯誤者，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

該次實驗以Ppro EX HTa表達為載體，行酶切位，高效轉錄Trc啟動子，以表達HSP65基因，有利于蛋白的分離純化，且表達較穩定，蛋白生物學活性保留較好。分離純化HSP65，行血清學檢測結果，顯示敏感度達68.75%、特異度達86.67%，高于LAM、16 kDa，與38 kDa基本持平，后三者均為目前臨床常用的MTB感染血清學診斷標志物，提示HSP65可作為血清學診斷TB單獨標志物。此外，HSP65+38 kDa敏感度高于HSP65，HSP65特異度高于16 kDa，差異有統計學意義（P<0.05），提示聯合檢測可能提高檢測敏感度，但無法有效提高特異度。關于LAM、16 kDa、38 kDa血清學診斷肺結核研究較少，敏感度在40%～90%之間，如林楠等以4種結核抗原進行結核病血清學診斷，單獨應用靈敏度在30.9%～66%，特異度76.2%～90.5%，不同學者研究結果存在較大差異，這與不同患者肺結核嚴重程度、結核分枝桿菌活動度存在較大差異納入患者標準不統一有關，血清學檢測運用于結核病診斷敏感度仍較低，大規模推廣尚需時日。

該次研究表明，HSP65診斷正確者抗酸染色陽性比重、PPD皮試陽性比重差異無統計學意義（P>0.05），提示抗酸染色陽性比重、PPD皮試陽性不能真實反映MrrB應激狀態。HSP65血清抗原檢測正確者X線片結核空洞影比重高于錯誤者，差異有統計學意義（P<0.05），提示X線片空洞形成與MTB應激有關，提示患者病情已進入或將要進入活動期。劉志輝等對結核性胸膜炎患者結核分枝桿菌培養濾液、胸腔積液和血清蛋白質組進行分析，結果顯示濾液、胸液與血清特異性蛋白質標志物密切相關，而濾液、胸腔積液與空洞形成有關。目前，已有血清學快速診斷肺結核技術，孟煒而等以血清腺苷脫氨酶診斷肺結核敏感度達94.0%、特異性70.7%，具有較高的應用價值，HSP65在結核病血清診斷中的應用仍有待時日。