外泌體源性細胞外microRNAs在泌尿系統惡性腫瘤中的研究進展*

王愛香 綜述 暢繼武 審校

·綜述·

外泌體源性細胞外microRNAs在泌尿系統惡性腫瘤中的研究進展*

王愛香 綜述 暢繼武 審校

microRNAs（miRNAs）是一種內源性單鏈非編碼微小RNAs分子，可通過堿基互補方式與靶mRNA的3'非翻譯區（3' UTR）特異性結合誘導其降解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平有效地沉默靶基因的蛋白表達。miRNAs因可以上述方式調節癌基因或抑癌基因表達，故其廣泛參與了腫瘤的發生發展過程。本文概括了miRNAs的起源、功能及生物體液中外泌體（exosome）源性細胞外miRNAs的穩定性。同時對從尿液外泌體中尋找泌尿系統惡性腫瘤潛在miRNA標記物的現實可行性以及尿液中外泌體源性miRNAs在前列腺癌、膀胱癌及腎癌中作為生物標記物的潛能進行綜述。

泌尿系統腫瘤 細胞外miRNAs 外泌體

miRNAs是一種內源性單鏈非編碼微小RNAs分子，長度為19～23 nt，長期以來一直被認為是轉錄的副產品。目前的研究表明miRNAs在生理及病理過程中具有重要功能性意義，幾乎參與所有已知腫瘤發生的相關過程，如細胞生長、分化、增殖、血管形成、凋亡、浸潤及轉移等［1］。最近的研究顯示體液中可檢測到活性細胞釋放的miRNAs，這些miRNAs統稱為細胞外miRNAs，通常穩定存在于體液中而免于降解，微囊泡尤其是外泌體（exosomes）是細胞外miRNAs的一種主要保護機制且在細胞間通訊中發揮重要作用［2］，其在包括泌尿道惡性腫瘤的各種人類腫瘤中被作為有前景的疾病診斷與預后生物標記物。

膀胱癌、前列腺癌、腎癌是泌尿道三大惡性腫瘤。前列腺癌是美國男性最常見的癌癥，每年新診斷的患者為240 000多例［3］。膀胱癌在美國男性最常見的癌癥中位居第3位，據統計2012年新發病例73 510例，死亡14 880例［3］。在我國由于人們生活水平的不斷提高及工業化進程的加快，泌尿道惡性腫瘤的發病率與死亡率逐年增加。盡管在治療方面已經取得很大進步，但無創簡便的惡性腫瘤檢測方法的發展，疾病早期的診斷水平提高仍是泌尿外科醫生需要面對的挑戰，同時需要回避穿刺及其他傳統診

斷方法對患者的損傷。就上述問題，新近研究發現的外泌體源性miRNAs作為診斷及預后生物標記物給患者帶來了曙光。

1 miRNAs的生物起源與主要功能

細胞內miRNA分為內源性與外源性兩種不同亞群。miRNA生物起源遵循中心法則：在細胞核中miRNA基因被RNA聚合酶Ⅱ轉錄為長度＞500 nt的初級miRNA發夾（pri-miRNAs）；pri-miRNAs被Drosha/DGCR8裂解為長度65～75 nt的前miRNAs（premiRNAs），由Exportin 5從細胞核轉運至胞漿；在胞漿中pre-miRNAs被Dicer進一步修剪為長度19～23 nt的成熟miRNAs［4］。上述途徑產生的miRNAs組成了細胞內大部分的miRNAs。細胞內miRNAs的另一種來源為細胞外環境。目前研究者們普遍認為細胞可能釋放包含miRNAs的復合物進入血液、唾液、尿液及乳汁等生物體液中［5］，這些復合物包括miRNAs結合蛋白［6］、高密度脂蛋白（HDL）［7］、或者微囊泡。當這些復合物在血液中循環時，可能被遠隔的細胞捕獲，實現miRNAs介導的細胞間通訊。

成熟miRNAs通過調節靶mRNAs對細胞功能具有顯著影響。miRNAs與Ago 2形成RNA誘導的沉默復合體（RISC），然后以完全或不完全配對方式結合到靶mRNAs的3'非編碼區（3'UTR）。如果miRNAs與mRNAs之間完全配對，靶mRNAs被核酸內切酶裂解；如果二者間不完全匹配，靶mRNAs的翻譯被抑制。據估計，約1 000個miRNAs調節著30%以上的人類基因［8］。

2 生物體液中外泌體源性miRNAs的穩定性及可檢測性

外泌體是細胞內多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）的腔內囊泡，在MVBs與細胞膜融合之后以胞吐的方式釋放入細胞外環境中，直徑為50～100nm。外泌體含有能反映其來源細胞生理及病理狀態的多種蛋白質、mRNAs及miRNAs，在其形成過程中上述生物分子有一個選擇性富集過程，因此外泌體攜帶有豐富的生理或病理生物標志物信息［5］。研究顯示外泌體被大量釋放于生物體液中，包括血液、尿液、腦脊液、惡性胸腹水、羊水及滑液等［9］。外泌體能夠攜帶RNA分子循環于血液中進行長距離的細胞間通訊，鑒于此試圖從各種體液中提取外泌體的RNA作為疾病診斷與預后標記物研究。

用于診斷和預測預后的理想生物標記物應滿足以下標準：通過無創性方法易于獲得，高度的敏感性及特異性，具有檢測疾病早期階段的能力，樣本有較長的半衰期以及快速準確的檢測方法等。其中無創性方式是最基本的獲得要求，以無創性方法收集的常見生物體液是血清與血漿，其中循環miRNAs近年來備受關注。與mRNAs相比較，循環miRNAs比較穩定，能耐受儲存與凍融循環延長等物理降解，同時也能抵抗血清中核糖核酸酶（RNAse）及體外RNAse A等生物化學降解［10］。在富于RNAse的血液環境中，許多機制保護循環miRNAs，其中外泌體被認為是一種主要的保護機制［11］。外泌體的外膜對RNA提供了全面的保護，其將與易于消化的細胞外環境隔絕。以無創性方法收集的另一種常見生物體液是尿液，尿液不僅容易獲得，而且收集簡便、無創、數量大，因此尿液是一種反映泌尿系統疾病潛在miRNAs標志物的理想液體。由于排泄之前尿液通過泌尿系統惡性腫瘤的病灶，因此其miRNAs含量常常反映疾病的狀態。存在于尿液中的miRNAs與循環miRNAs的保護機制大致相同，但由于尿液成分復雜，而且泌尿系統中存在大量的RNAse活性，使得尿液中的裸miRNAs更易于降解，因此研究源于外泌體的miRNAs更具有現實意義。

尿液外泌體可來源于泌尿道腫瘤（如前列腺癌、膀胱癌及腎癌）、正常泌尿上皮、腎小球或腎小管。一項腎臟疾病的研究中，在尿液外泌體RNA提取之前用RNase A對外泌體沉淀進行處理，結果顯示處理組與未處理組均穩定表達AQP2及CD24，且兩組間Ct值無明顯差異［12］。另一項研究分別從全尿液，尿細胞沉淀，無細胞尿液，無外泌體尿上清液及尿液外泌體中提取RNA，并對長度＜200 nt的miRNAs進行了分析，結果僅在尿液外泌體中發現了富集完整的miRNAs［13］。盡管尿細胞沉淀中包含了一定數目的miRNAs，但是大部分已降解。進一步的研究結果顯示在3例不同受試者尿樣中應用高通量深度測序法檢測到184個外泌體相關miRNAs，而其中僅7個miRNAs與無細胞尿液共有。上述結果表明尿液外泌體中不僅含有豐富完整的miRNAs，而且對RNAs具有很好的保護作用。

3 泌尿系統惡性腫瘤中外泌體源性miRNAs的診斷與預后意義

前列腺癌細胞外miRNAs的研究主要集中在血清與血漿。血液中存在兩個有前景的miRNAs，即miRNA-141與miRNA-375。在轉移性前列腺癌患者血漿中，miRNA-141的水平是健康對照的46倍［14］。血漿miRNA-141與miRNA-375表達水平可區別轉移性與非轉移性患者［15］，血清miRNA-141與miRNA-375表達水平與高Gleason評分及陽性淋巴結數目相關［16］。通過從血清中分離外泌體s與微囊泡，Bryant等［15］進一步證明，與無復發患者比較轉移性前列腺癌患者的miRNA-141與miRNA-375表達明顯

上調，同時研究也顯示前列腺癌患者尿沉淀與組織樣本細胞內miRNAs中的miRNA-141表達上調，提示miRNA-141作為前列腺癌診斷與預后標記物的潛能。在另一項研究中，Huang等［17］在23例激素抵抗型前列腺癌患者篩查組中進行了RNA測序分析，并在隨訪組中對100例該類患者應用qRT-PCR技術進一步評估血漿外泌體源性miRNAs作為預后生物標記物的價值。結果在隨訪組中，miRNA-1290與miRNA-375的高水平與較低的總生存率明顯相關（P＜0.004）。將miRNA-1290/miRNA-375與激素抵抗型前列腺癌分期模型中的假設臨床預后因子合并后預測性能明顯提高，時間依賴性曲線下面積從0.66增加到0.73，提示血漿外泌體源性miRNA-1290與miRNA-375是激素抵抗型前列腺癌患者具有前景的預后生物學標記物。

miRNAs水平的上述改變不僅可以發生在前列腺癌患者血清及血漿中，也可能發生在尿液中。有研究報道，墨西哥的前列腺癌患者尿細胞沉淀中證實了21個miRNAs存在明顯的表達變化，miRNA-196b、miRNA-574-3p，let-7b、-7c、-7d、-7e、-7g，miRNA-200b、-149、-20b、-17、-184、-20a、-106a、-671-3p、-148a、-429、-31和miRNA-100表達明顯增加，miRNA-150與miRNA-328表達下調［18］，但這些結果仍需要在更大的患者群體中進一步分析。另一研究為了探討miRNAs作為前列腺癌非侵襲性生物標記物的潛能，對尿樣中經芯片及qRT-PCR研究證實的前列腺癌組織中明顯表達失調的miRNAs進行了分析，miRNA-205與miRNA-214表達明顯下調，二者聯合使用能區別前列腺癌患者與健康對照，敏感性與特異性分別為89%與80%，上述結果強調了miRNA-205與miRNA-214作為前列腺癌患者非侵襲性生物標記物的潛能［19］。

膀胱癌診斷與預后的miRNAs標記物研究大部分采用尿液。Hanke等［20］在膀胱癌患者尿液中確定了157個miRNAs的表達圖譜，鑒定出miRNA-126、miRNA-182與miRNA-199a的表達水平明顯增加，同時也發現尿液中miRNA-126與miRNA-152的比值能夠檢測膀胱癌，敏感性、特異性及曲線下面積分別為72%、82%及0.768。另一項研究表明，尿液中的miRNA-96與miRNA-183在區別膀胱癌與非癌患者方面均具有較高的敏感性與特異性，miRNA-96分別為71.0%與89.2%，miRNA-183分別為74.0%與77.3%。在該研究中與健康對照者比較，膀胱癌患者尿液中miRNA-96與miRNA-183表達水平明顯升高，但術后尿液中上述兩種miRNAs的表達水平明顯降低，此外miRNA-96與尿細胞學結合時，可將尿細胞學的敏感性從43.6%提高到78.2%，因此miRNA-96可以作為一個優良的診斷標記物［21］。Wang等［22］行尿液離心分離后，分別對膀胱癌患者的尿液沉淀和上清液進行miRNAs表達研究，尿液沉淀中miRNA-200家族、miRNA-192及miRNA-155低表達，尿液上清液中miRNA-192低表達，但miRNA-155高表達。該研究的腫瘤組織切除后尿液沉淀中miRNA-200家族表達增加。上述研究結果表明miRNAs在尿液中作為膀胱癌非侵襲性生物標記物的潛能。

腎細胞癌中關于miRNAs的研究主要描述了miRNAs在鑒別腫瘤組織與腎實質、腎細胞癌的組織學分類及預后判斷方面的重要作用。其中僅一項研究［23］是關于腎細胞癌患者尿液miRNAs的檢測，miRNA-15a作為一個腎細胞癌的抑制基因促進凋亡，同時通過與α同型蛋白酶C（PKCα）的緊密結合抑制細胞增殖，PKCα直接通過分子相互作用抑制miRNA-15a的初級轉錄本pri-miRNA-15a的細胞核釋放，降低的PKCα水平導致miRNA-15a表達增加。在活組織檢查與尿液樣本中，miRNA-15a上調也可能是一種鑒別透明細胞腎細胞癌與良性腎腫瘤的重要生物標記物。

4 展望

體液中提取外泌體源性細胞外miRNAs作為泌尿系統腫瘤診斷與預后生物標記物的研究雖剛剛開始，但已經顯示出巨大潛力。由于研究對象與方法的不同可能產生不同的結果，患者的招募、樣本的收集、miRNAs的提取及定量的標準化非常重要。目前的研究總體上基于小樣本患者，大樣本多中心研究亟需開展。

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（2015-01-13收稿）

（2015-03-27修回）

Research progress on exosomal microRNAs in urologic malignancies

Aixiang WANG,Jiwu CHANG

Jiwu CHANG;E-mail:wax20030826@126.com

Micro-ribonucleic acids(miRNAs)are endogenous single-stranded small non-coding RNAs.miRNAs bind to a complementary site in the 3'untranslated region of their target mRNAs through canonical base pairing,which can direct the degradation or translational repression of these transcripts.Thus,miRNAs can effectively silence the protein expression of target genes post-transcriptionally.miRNAs may also regulate the expression of oncogenes and tumor suppressor genes and could be involved in almost all known hallmarks of cancinogenesis.In this paper,we discuss the following in detail:(1)biogenesis and main functions of cellular miRNAs,(2)stability and detectability of exosomal miRNAs in biological fluids;and(3)feasibility of miRNAs as a potential new class of biomarkers derived from urinary exosome in the malignancy of urinary system.Finally,we summarize studies on urinary exosomal miRNAs as potential biomarkers of prostate,bladder,and kidney cancers.

tumors of urinary system,extracellular miRNAs,exosome

10.3969/j.issn.1000-8179.20150060

天津醫科大學第二醫院天津市泌尿外科研究所（天津市300211）

*本文課題受天津市應用基礎與前沿技術研究計劃青年項目（編號：13JCQNJC11500）及天津市衛生局科技基金項目（編號：2013KZ110與2013KZ113）資助

暢繼武wax20030826@126.com

Tianjin Institute of Urology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

This work was supported by a grant from the Application Base and Frontier Technology Project(No.13JCQNJC11500)and the Science and Technology Foundation of Tianjin Public Health Bureau of China(No.2013KZ110 and 2013KZ113)

王愛香專業方向為泌尿系統腫瘤分子病理學及發病機制。

E-mail：wangaixiang@tijmu.edu.cn