妊娠期糖尿病大鼠胰腺組織中P-PERK、ATF4和CHOP蛋白的表達*

豐樹煥，張東銘，樂 婷，張蘇河#，付艷芹

1)鄭州大學第二附屬醫院內分泌科 鄭州450014 2)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州450014

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期間首次發生的不同程度的糖代謝異常，可致母兒嚴重的并發癥。GDM 是一種多因素疾病，其病因復雜，胰島素抵抗和胰島β 細胞凋亡是目前GDM 發病機制中研究較多的因素。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來1型、2 型糖尿病發病機制研究的熱點，但在GDM 中研究較少。ERS 可促進胰島素抵抗和β 細胞凋亡，蛋白激酶R 樣內質網激酶(PERK)-C/EBP 同源蛋白(CHOP)作為ERS 經典的信號通路，在胰島β 細胞凋亡中起關鍵作用［1］。作者通過觀察GDM 模型大鼠胰腺組織中磷酸化PERK(p-PERK)及ATF4 蛋白活化的情況，并分析ATF4 與凋亡相關蛋白CHOP表達的相關性，了解p-PERK、ATF4、CHOP 蛋白活化在GDM 胰島β 細胞凋亡發生中的作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及飼料 SPF 級健康雌性SD 大鼠30只購自河南省實驗動物中心，平均周齡為4 周，平均體重為(110．8±14．9)g。普通飼料(標準嚙齒類)和高脂高糖飼料［1］均購自河南省實驗動物中心。

1．2 動物分組及GDM 大鼠模型建立 所有雌性SD 大鼠普通飼料適應性喂養1 周，時間標記為W1，按照隨機數字表法分為2組:模型組和對照組，每組15只，分別給予高脂高糖飼料和普通飼料。喂養6周后，記為W7，按2∶1 與雄性SD 大鼠合籠，次晨陰道涂片鏡檢精子(+)計為孕1 d。標記并隔離孕鼠。合籠1 周后測定非空腹血糖，如血糖濃度≥6．7 mmol/L 則模型復制成功［2］，棄用未孕及血糖未達標大鼠，2組大鼠妊娠1 周后記為W9。

1．3 標本采集與方法

1．3．1 標本采集 妊娠第21天所有大鼠隔夜禁食12 h 后，體積分數10%水合氯醛腹腔麻醉，一側頸動脈及對側股靜脈插管行靜脈葡萄糖耐量(IVGTT)及靜脈胰島素釋放實驗(IVIRT)。結束后放血處死動物，快速分離胰腺組織，一部分置于甲醛溶液中固定，以備HE 染色、細胞凋亡及免疫組化檢測使用;一部分置－80℃冰箱以備Western blot 使用。

1．3．2 HE 染色 取胰腺組織后常規石蠟包埋、切片，HE 染色后觀察胰腺組織的病理組織學變化。

1．3．3 細胞凋亡檢測 每只大鼠取切片1 張，按照凱基TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒進行操作。細胞核呈深棕色為染色陽性細胞，即為凋亡細胞。每張切片選取5個視野(×400)，分別計數凋亡細胞數和總細胞數，凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1．3．4 p-PERK 蛋白的檢測 采用免疫組化SP法。石蠟包埋大鼠胰腺組織，2～3 μm 切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS 沖洗3次，高壓抗原修復5 min，自然冷卻，PBS 沖洗3次，用二抗同源血清進行封閉，甩掉血清，滴加p-PERK 兔抗鼠多克隆一抗(稀釋100 倍使用)(上海拜力生物科技有限公司)50 μL，室溫下孵育1 h;滴加二抗50 μL，室溫孵育15 min。DBA 顯色，蘇木素復染，脫水，透明及封片。

1．3．5 ATF4、CHOP 蛋白檢測 采用Western blot方法。胰腺組織剪成小塊，按每20 mg組織加100～200 μL 的比例加入蛋白裂解液，14 000 r/min ×5 min，取上清。BCA 法初步測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE 電泳，每孔上樣量30 μg，樣品分離后轉移至PVDF 膜，100 V 恒壓1 h20 min，硝酸纖維素封閉，TBST 洗膜。分別加入ATF4、CHOP 一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST 洗膜，加入二抗37℃孵育45 min，TBS 洗膜、蒸餾水漂洗后，ECL 顯影，暗室壓片。以β-actin 為內參對照。將膠片掃描后用Bandscan 5．0 軟件進行灰度分析。

1．4 統計學處理 應用SPSS 20．0 處理數據，2組大鼠不同時間血糖和血胰島素水平比較采用重復測量數據的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。2組大鼠胰腺組織中p-PERK、ATF4、CHOP 蛋白表達水平的比較采用兩獨立樣本t 檢驗。模型組大鼠胰腺組織中ATF4 和CHOP 蛋白的相關性采用直線相關分析。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 2組大鼠不同時間血糖值比較 2組大鼠適應性喂養1 周后，血糖值無顯著差異，對應飼料喂養6周后，模型組大鼠的血糖值高于對照組;妊娠1 周后，模型組大鼠血糖值高于對照組，見表1。

表1 2組大鼠不同時間血糖值比較 mmol/L

2．2 2組大鼠妊娠第21天時血糖和血胰島素水平比較 模型組大鼠第一時相胰島素分泌受抑制，胰島素分泌峰值延遲。見表2。

表2 2組大鼠妊娠第21天時的血糖、血胰島素值比較

2．3 2組大鼠胰腺病理組織學觀察 對照組胰島形態尚規則，有少許出血發生，可見少許空泡變性發生;模型組胰島形態欠規則，胰島數目減少不明顯，細胞排列紊亂，部分細胞呈空泡變性，出現核固縮和裂解，可見以淋巴細胞、單核細胞為主的炎細胞浸潤，可見毛細血管擴張、充血，有出血發生，見圖1。

圖1 2組大鼠胰腺病理組織學觀察(HE，×400)

2．4 2組大鼠胰腺組織中細胞凋亡水平 2組大鼠胰腺細胞凋亡情況見圖2。模型組大鼠細胞凋亡率［(18．55 ±1．29)%］較對照組［(8．47 ±0．78)%］升高(t=21．164，P＜0．001)。

圖2 2組大鼠胰腺細胞凋亡情況(TUNEL，×400)

2．5 2組大鼠胰腺組織中p-PERK 蛋白的表達對照組大鼠胰腺組織p-PERK 蛋白的表達水平為(0．297 ±0．010)，低于模型組的(0．615 ±0．020)(t=44．178，P＜0．001)。見圖3。

圖3 2組大鼠胰腺組織p-PERK 蛋白的表達情況(SP，×400)

2．6 2組大鼠胰腺組織中ATF4 及CHOP 蛋白的表達 見圖4。與對照組相比，模型組大鼠胰腺組織中ATF4 蛋白和凋亡蛋白CHOP 的表達水平分別為(0．57 ± 0．02)和(0．51 ± 0．03)，高于對照組 的(0．18±0．03)和(0．22 ±0．04)(t =49．249 和39．664，P＜0．001)。模型組大鼠胰腺組織中ATF4 和CHOP蛋白的表達呈正相關(r=0．810，P=0．004)。

圖4 2組大鼠胰腺組織中ATF4 和CHOP 蛋白的表達

3 討論

由于需要合成和分泌大量的胰島素，β 細胞具有一系列獨特的功能，其中之一就是具有高度發達的內質網(endoplasmic reticulum，ER)，后者是蛋白質生物合成、折疊及運輸的重要細胞器，也是鈣離子的儲存庫。當各種刺激引起未折疊或錯誤折疊的蛋白質在ER 蓄積，機體將啟動保護性機制即未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，簡言之，UPR 通過減少新合成蛋白質向ER 運輸或增加蛋白折疊能力，最終恢復細胞穩態。然而，如刺激因素持續存在，將激活凋亡通路進而導致β 細胞凋亡，這種轉變稱為ERS［3-4］。已有研究［5-6］證明ERS 誘導的細胞凋亡與多種疾病密切相關，如肥胖、糖尿病、神經退行性病變、缺血性疾病、腫瘤等。目前廣泛接受的與ERS 凋亡相關的通路包括:IRE1α 誘導的細胞凋亡相關通路及CHOP 誘導的細胞凋亡相關通路，后者在各型糖尿病中均有研究，但在GDM 中研究較少。

PERK 是ER 膜上的一種Ⅰ型跨膜蛋白，當ERS發生時，PERK 通過寡聚化和自身磷酸化，進而抑制真核生物翻譯起始因子eIF2α 的磷酸化，即可以抑制幾乎所有的mRNA 的轉錄，然而卻可以誘導如ATF4 mRNA 的翻譯，ATF4 繼而調控ATF3、CHOP和Tribbles 同源蛋白3 的表達［7］，進而導致細胞凋亡的發生。ERS 時，PERK、IRE1 和ATF6 都能誘導CHOP 的轉錄，PERK-eIF2α-ATF4 是CHOP 蛋白所必需的［8］。Eizirik 等［9］在糖尿病動物模型中發現，CHOP 基因敲除的Akita 小鼠ERS 誘導的β 細胞凋亡減少，從而延遲糖尿病的發生，因此，CHOP 是持續性ERS 誘導程序性細胞死亡的關鍵啟動因子和標志物。

該研究結果中IVGTT 及IVIRT 結果反映出模型組大鼠第一時相胰島素分泌受抑，胰島素延遲釋放;β 細胞凋亡率較對照組升高，提示高脂高糖飲食可致胰島β 細胞功能障礙，進而導致細胞凋亡的發生。胰腺病理組織學觀察發現模型組有空泡變性，提示高脂高糖對胰島有損害作用。在高血糖刺激下，β 細胞仍能分泌較多的胰島素以滿足需要，表現為血胰島素水平升高。但長期高脂飲食對胰島畢竟有損害，故表現為β 細胞分泌胰島素能力相對不足。胰腺組織p-PERK 蛋白在模型組大鼠表達明顯增加，說明高脂高糖飲食可以誘導ERS 的發生。模型組大鼠胰腺組織ATF4、CHOP 蛋白表達均升高，且ATF4 與CHOP 蛋白表達呈正相關，ATF4 誘導下游CHOP 蛋白表達升高是細胞由自噬轉向凋亡的關鍵環節，與Matsumoto 等［10］的研究結果一致。

綜上所述，可以認為高脂高糖飲食誘導ERS 的發生，PERK-ATF4-CHOP 通路被激活，PERK 通路的活化與GDM β 細胞凋亡密切相關，CHOP 基因的過度表達可能在β 細胞凋亡中起著關鍵作用。

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