免疫學方法在混合精斑檢驗中的應用

張金輝(綜述),封　宇(審校)

(重慶警察學院刑事科學技術系，重慶 401331)

免疫學方法在混合精斑檢驗中的應用

張金輝※(綜述),封宇(審校)

(重慶警察學院刑事科學技術系，重慶 401331)

摘要：作為最常見的人體斑痕類型之一的精斑是法醫物證檢驗的重要步驟，其確認往往是性侵犯案件定性的最重要證據之一，對混合精斑進行分離確證也是證物檢驗中的難點之一。傳統的精斑檢測主要依靠精子鏡檢、組織化學方法等方法，但是存在明顯的不足之處。近年來，隨著生物分子水平的迅速發展，抗原抗體反應及基因組學在精斑鑒定的法醫實踐中得到了應用。

關鍵詞：免疫學方法；混合精斑；檢驗；應用

精斑是精液浸潤或附著于基質上，干燥后形成的斑痕，主要由精子及精漿組成，是一種含蛋白質、各種酶及果糖等多種成分的堿性乳白色膠狀液體。精斑是強奸案等性犯罪最重要的證據之一，對案件性質的確定具有重要的決定性作用。其檢測方法主要有精子鏡檢、組織化學方法及免疫學方法等，各種方法各有優缺點和適用的范圍[1]。免疫學方法是指運用抗原抗體反應的原理，特異性地對混合精斑進行確認的方法。由于免疫學方法具有操作簡單、快速、經濟等優點，已廣泛地應用于混合精斑的檢驗。現對免疫學方法在混合精斑檢驗中的應用進行綜述，以期為相關研究提供參考。

1抗前列腺特異性抗原膠體金免疫試紙條

又稱精斑試紙條，是利用免疫學方法，如免疫電泳、斑點分子雜交法、斑點免疫結合、酶聯免疫吸附試驗等和色譜層析技術如薄層免疫測定等對前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)(P30)進行特異性檢測的一種簡便方法[2]。前列腺特異性蛋白是一種由前列腺分泌的人精液所特有的具有抗原性的糖蛋白，對其進行檢測已成為確證精斑最有效的方法之一，尤其是對微量陳舊檢材。該方法具有操作簡單、經濟、快速、特異性強、靈敏性高、結果易判讀以及沒有特殊設備要求等諸多優勢，因此廣泛地應用于法醫學的實際精斑確證試驗檢案中。抗P30膠體金免疫試紙條是目前我國法醫學檢案中最常用的確證精斑的手段。有研究指出，對于濃度稀釋至6000倍的精液，采用精斑確證試驗獲得的陽性結果依然是比較可信的[3]。為了更加方便、簡單、快速地應用該免疫層析技術，使其擁有更大的優勢，目前已經有大量成熟的快捷精斑試紙條投放入市場供使用。一般的試紙條的其靈敏度即可達4000～6000倍，還有的可以精確到萬倍以上[4]。由于廠家的不同，所生產出來的產品在敏感性上也存在差異。臨床上主要的商用試劑條有Bioengine、Chembio、Medpro、SPERM HY-LITER、One Step ABA card、Onco-screen、Seratecl PSA Semiquant和PSA check-1等[5]。在實際應用中，除了規范操作步驟外，還要避免假陽性的出現。各種具體的實際情況都可能會影響到其精確度和敏感性，如檢測時精斑浸液過濃、時間過長、遭水洗破壞、種屬之間發生交叉反應等，均有可能使結果出現假陰性現象[6-7]。另外，文獻報道，濃度在6.4%以上的NaCl溶液可能會使該反應產生假陽性反應。可見，傳統的精斑確證方法在多個方面(敏感性、特異性、實用性)等均存在著一些缺陷，有必要對其進行優化改進。

2信使RNA

個體一般存在兩種不同類型的基因，一種為管家基因，廣泛存在于所有組織中的細胞，負責細胞功能的維持。另一種基因稱為非管家基因，指專一性地表達于特定組織，比如人體的淋巴細胞、白細胞和陰道上皮細胞、精子等終末分化細胞的形成就由這種特定基因的關閉或開啟決定[8]。RNA在不同功能和不同類型的組織或細胞中的表達模式存在差異。如果對斑痕的信使RNA(mRNA) 的種類進行分型確定，就可以識別其組織來源。mRNA檢測的步驟通常如下：首先采用Trizol法對樣本RNA進行提取和收集，接著用 DNase I對mRNA 進行消化，加入逆轉錄所需要的核苷酸分子后，逆轉錄合成互補DNA，最后采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀進行PCR擴增，得到大量的產物及對產物進行測序等[9]。由于RNA 酶廣泛存在于細胞和環境中，離體后被迅速降解，故一般認為mRNA 是極其不穩定的，不可能作為理想的法醫分子標記。但隨著醫學技術的發展，RNA在干燥斑痕中的穩定性得到證實。而且基因組和逆轉錄PCR技術的廣泛應用也使RNA作為法醫證據檢測方法得到實現。但是在實際應用中，仍然需要謹慎的對待逆轉錄PCR 出現的實驗陰性結果，因為 RNA穩定性遠遠比不上DNA，各種不適應的保存環境、對RNA提取及逆轉錄的過程中操作不當均容易導致 mRNA 的降解，進而出現陰性結果。可以說，利用組織特異性RNA進行斑痕檢測已經成為目前法醫學科斑痕標記研究的熱點之一[10]。

自1989年Pessot等[11]首次在實驗室對成熟精子mRNA 進行檢測以來，已經有很多實驗室開展相關的研究。Bauer和Patzeh[12]于2003年首次證明，成熟精子的核蛋白魚精蛋白1 和2是特異性的精子標志物，對包括血液、陰道拭子、唾液和人體組織等不含精子的樣本的魚精蛋白1和魚精蛋白2檢測均呈陰性，表明核蛋白魚精蛋白1和魚精蛋白2適合作為精子的標志物。2006年，Nussbaumer等[13]采用逆轉錄實時熒光定量PCR技術通過mRNA檢測進行了體液斑鑒定的研究。2008年，Haas等[14]采用與精子標志物魚精蛋白1 和 魚精蛋白2對放置15個月的精斑進行檢測，檢出結果為陽性。此后，越來越多的基于檢測mRNA的體液斑確證方法研究陸續被報道出來。

相對傳統精斑確證試驗而言，利用mRNA進行精斑標記具有特異性強、敏感性高、干擾少、檢測結果可靠等優點。但mRNA的檢測需要用到PCR擴增儀等比較大型的儀器，只能在特定的實驗室操作完成，需要經過專門培訓的實驗人員，消耗的耗材也相對比較昂貴，而且mRNA也比較容易酶解，這一定程度上也限制了其應用。

3微RNA

微RNA(microRNA，miRNA)是一種長度為18～23 nt的單鏈非編碼小分子RNA，由具有發夾結構且長度為70～90 nt的單鏈RNA前體經過Dicer酶切后生成[15]。Hanson等[16]指出，mRNA一般其擴增產物長度比較長，容易斷裂，具有一定的缺陷。他們在451個miRNA基因座中篩選出9個在某一種體液中表達較高而在其他體液中不表達或表達較低的miRNA標記(miR-10b、miR-16、miR-124a、miR-135b、miR-205、miR-372、miR-412、miR-451和miR-658)，其中2個標記成功(miR-10b及miR-135b)應用于精斑的檢測。此后有許多具有組織特異性的miRNA被相繼識別。

4DNA甲基化

隨著后基因組時代的到來，法醫DNA分析技術在法醫鑒定中的作用越來越重要。DNA甲基化由于其具體的特異性和穩定性已經成為目前最為理想的法醫分子標記[17]。DNA 甲基化主要是指DNA復制后主要在CpG二核苷酸的胞嘧啶上進行共價修飾而成的核酸。這種修飾不改變 DNA 的序列，但可以對基因的表達進行調控。在分化的體細胞，基因組甲基化模式通常是穩定、可遺傳的[18-19]。組織之間廣泛存在的甲基化差異位點理論上均可以作為候選的斑痕標記。DNA 甲基化的發現為研究者在 DNA 水平進行斑痕鑒別提供了可能。2005年，趙貴森和楊慶恩[20]首次提出了根據 DNA 甲基化進行法醫組織斑痕鑒別的思路。2012年，劉峰等[21]采用DNA IQTM System試劑盒成功檢驗了1例精斑。隨著技術的不斷改進，已經有越來越多的采用DNA甲基化原理的試劑盒被應用到精斑的檢測中[22-24]。DNA甲基化由于其穩定的理化性質，以及高敏感性、高特異性等優點，越來越顯示出具有廣闊應用前景的新型分子標記。

5免疫磁珠技術

通過將特異性的抗體與磁性微球進行偶聯，利用磁性分離技術，可達到對精陰混合斑中精子進行捕獲和檢測。免疫磁珠技術具備其他方法所缺少的固相化試劑的優點。目前，精子特異性抗原對應的單克隆抗體及多克隆抗體已經有商品化的試劑可以購買，同時免疫磁珠結合配基的技術發展也已經十分成熟。2007年Anslinger等[25]針對精子表面的血管緊張素轉換酶抗原篩選出3種抗體1E10、4E3和4E10制備免疫磁珠，并且成功進行了分離。2011年國內學者也對該技術進行了初步研究，利用人精子魚精蛋白抗體和抗SPAG8抗體成功對精子細胞進行的捕獲和分離。可以說，免疫磁珠技術由于具備了抗原抗體的高特異性和其本身固有的固化性，具有較好的法醫學應用前景[26]。

6其他

精液特異性抗原可被單克隆抗體MHS-5(精囊腺上皮細胞分泌的特異蛋白質)識別，其具有很高的靈敏度，但是特異性不如PSA試驗，現在已經很少使用。其他用于精液檢測的抗原主要有單克隆抗體1E5、精液凝固蛋白 Ⅱ、19-OH F1a/F2a前列腺素等。

7小結

精斑是法醫實踐中常見的物證檢材。在強奸、猥褻等案件中，對精斑的檢驗可以為案件的偵查提供線索，為分析、審理案件提供證據。隨著犯罪手法的日益復雜，對微量精斑鑒別提出了更高的技術要求。傳統的鏡檢精斑已經無法滿足法醫學的需求。應用免疫學原理，在核酸分子水平進行的精子特異性的分子標記，高度靈敏、特異、結果可靠，有望成為未來進行斑痕確證的主要方法。但是，利用核酸分子水平進行精斑鑒別目前還不是很成熟，還處于起步階段，進行法庭提供證據，還需要輔助采用其他較為成熟的檢驗方法。

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The Application of Immunological Method on the Identification of Mixed Seminal StainsZHANGJin-hui,FENGYu.(DepartmentofCriminalScienceandTechnology,ChongqingPoliceAcademy,Chongqing401331,China)

Abstract：The authentication of seminal stains is one of the important means in forensic tests.Being one of the most important decisive evidence among the crimes of rape,the authentication of mixed seminal stains is usually enormously difficult.Traditional identification of seminal stains mainly relies on the microscopic identification of spermatozoa,histochemical method,which still have defects.With the development of biological molecular level,antigen antibody reaction and genomics have been applied to semen stain identification.

Key words：Immunology; Mixed seminal stains; Identification; Application

收稿日期：2015-01-12修回日期：2015-04-24編輯：相丹峰

基金項目：重慶市公安局科技攻關計劃項目(2012-10)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.007

中圖分類號：R331； R89

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)22-4051-03