阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化斑塊穩定性及斑塊內血管新生的影響

曹桂秋　劉立志　王貴鵬宣曉崗李玲玲(新疆醫科大學第五附屬醫院老年病科，新疆　烏魯木齊　8300)

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阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化斑塊穩定性及斑塊內血管新生的影響

曹桂秋劉立志王貴鵬1宣曉崗1李玲玲2
(新疆醫科大學第五附屬醫院老年病科，新疆烏魯木齊830011)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化(AS)斑塊穩定性及斑塊內血管新生的影響。方法將80只新西蘭大白兔按隨機數字表法隨機分為無藥物干預常規超聲造影組(A組)，無藥物干預超聲微泡造影組(B組)，阿托伐他汀干預超聲常規造影組(C組)，阿托伐他汀干預超聲微泡造影組(D組)，每組20只;建立AS模型后，利用免疫組化法檢測斑塊組織血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞分化抗原40配體(CD40L)，第8因子相關抗原(FVⅢRAg)及基質金屬蛋白酶(MMP)-3的蛋白表達;利用超聲造影技術對斑塊進行常規超聲及微泡造影檢查，并采用ACQ分析軟件得到斑塊的始增時間(AT)、到達時間(TTP)、峰值時間(PI)以及基礎強度(BI)，計算增強強度(EI);利用病理組織學檢查以及抗CD34免疫組化染色法，算出微血管密度(MVD)，并與造影參數進行相關性分析。結果所有模型高脂喂養后，相對于A組+B組，C組+D組的內皮細胞腫脹、變性減輕，且脂質沉積和泡沫細胞也減少;同時C組+D組AS斑塊內VEGF，FVⅢRAg，MMP-3和CD40L的陽性染色面積以及MVB值也均明顯低于A組+B 組(均P＜0. 01);另外D組AS斑塊EI值與MVD值呈正相關(r=0. 665，P＜0. 01)，高于C組AS的EI值與MVD值相關性(r=0. 401，P＜0. 01)。結論阿托伐他汀具有穩定AS斑塊的作用，抑制斑塊內血管新生可能為其機制之一，而超聲微泡造影劑有助于評價AS斑塊新生血管情況。

〔關鍵詞〕阿托伐他汀;動脈粥樣硬化;超聲造影;微泡;斑塊

1新疆醫科大學第五附屬醫院心內科

2新疆醫科大學第五附屬醫院超聲科

第一作者:曹桂秋(1972-)，女，博士，主任醫師，主要從事心血管疾病診治方面的研究。

動脈粥樣硬化(AS)是引發急性冠脈綜合發生的主要機制〔1〕。有研究發現，AS斑塊內有出現的病理性新生血管，它可能有助于促進粥樣硬化的發展，甚至導致斑塊破裂或斑塊內出血〔2〕。阿托伐他汀對AS斑塊具有穩定的作用，同時發現其能影響斑塊內血管新生〔3〕，但相關報道較少。而超聲造影劑作為血池顯影劑可以定量評價斑塊內新生血管數量以及斑塊穩定性。本研究通過使用高脂飲食及球囊導管血管損傷術制作兔腹主動脈AS斑塊模型，并利用超聲造影技術及免疫組化法進行定量分析，旨在探討阿托伐他汀對AS模型斑塊的穩定性以及其對斑塊內新生血管的影響。

1　資料與方法

1. 1一般資料健康新西蘭兔80只，體重2. 0～2. 5 kg，由溫州醫學院動物實驗中心提供，將其隨機分為無藥物干預常規超聲造影組(A)、無藥物干預超聲微泡造影組(B)、阿托伐他汀干預超聲常規造影組(C)、阿托伐他汀干預超聲微泡造影組(D)，各20只;高脂飼料由上海斯萊克實驗動物有限公司提供(含1. 5%膽固醇);阿托伐他汀由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號: 07455);免疫組化一抗工作液由北京博奧森公司提供; BX51光學顯微鏡(日本，Olympus公司); GE LOGIQ9超聲診斷儀(美國，GE公司)。

1. 2建立兔腹主AS斑塊模型所有實驗兔進行適應性喂養1 w后，均給予高脂飼料100 g/d，自由進食攝水，喂養2 w后進行腹主動脈球囊導管血管損傷術:耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，取右股動脈搏動最強處鈍性分離及穿刺，將2. 5 mm×15 mm的球囊導管送入腹主動脈處，推注7～8個標準大氣壓充盈球囊反復回拉造成動脈內膜損傷，并將結扎傷口逐層進行逢合。術后肌肉注射8萬單位的慶大霉素以預防感染。C組及D組在造模后在高脂飼料中拌入阿托伐他汀5 mg·kg-1·d-1，繼續喂養6 w。

1. 3超聲檢查使用GE Logiq 9超聲診斷儀，9 L探頭，頻率8 MHz。劍下掃查，待腹主動脈圖像穩定后，B組及D組經兔耳緣靜脈彈丸式注入超聲微泡造影劑(聲諾維)，按0. 02 ml/kg劑量;而A組及C組再注入SonoVue造影劑0. 1 ml后，啟動contrast條件開始同步計時，觀察斑塊增強特征，對過程進行圖像動態存儲，在脫機狀態下利用聲學定量分析軟件(ACQ)對圖像進行分析。記錄兔腹主動脈斑塊超聲造影感興趣區(ROI)，并使用時間-強度曲線(TIC)將兔腹主動脈斑塊的到達時間(AT)、達峰時間(TTP)、峰值強度(PI)以及斑塊的基礎強度(BI)進行記錄，計算增強強度(EI，EI=PI－BI)，并將EI值與免疫組織化學量化結果做相關性分析。

1. 4免疫組化檢測微血管密度(MVD)測定:所有實驗兔模型檢查后立刻處死，用10%甲醛固定目標斑塊標本，常規脫水，石蠟包埋，制備成4 μm厚連續切片，并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察動脈斑塊形態學表現。病理檢查后，用抗CD34單克隆抗體標記血管中層、斑塊基底部及纖維帽與斑塊肩部的內皮細胞，然后在200倍顯微鏡視野下計數每一視野的微血管數。MVD的測定方法: CD34陽性標準為血管內皮細胞呈棕褐色或棕黃色染色，將染成棕褐色的內皮細胞簇或單個內皮細胞視為1個血管計數，結構只要不相連，其分支結構也視為1個血管計數。微血管計數方法:首先在低倍鏡(40倍)下對切片進行觀察，找到3個血管染色最密集的地方，然后在高倍鏡(200倍)下對這3個視野分別進行微血管計數，取平均值作為該切片的MVD值。

AS斑塊內血管內皮生長因子(VEGF)、第8因子相關抗原(FVⅢRAg)，基質金屬蛋白酶(MMP)-3及白細胞分化抗原40配體(CD40L)的蛋白測定: 60℃條件下靜置切片1 h，使用二甲苯以及梯度乙醇進行脫蠟處理，使用5%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶15 min。4℃條件下采用一抗孵育過夜，再采用二抗結合30 min，并用二氨基聯苯胺(DAB)顯色以及HE復染，脫水后用中性樹膠進行封片。DAB顯色為棕黃色顆粒狀表示陽性結果，而斑塊內VEGF、FVⅢRAg、MMP-3以及CD40L陽性的區域面積占整個斑塊面積的比例可利用IPP軟件得到。

1. 5統計學方法應用SPSS17. 0軟件進行分析t檢驗、Person相關分析。

2　結果

2. 1一般情況在球囊導管血管損傷術操作過程中有4只兔死亡，而術后3只兔發生感染死亡，3只兔因飼料沒有食用完而退出實驗，其余70只兔均完成實驗，最終A、B、C、D組納入分析的實驗兔分別為18、17、18、17只。

2. 2病理形態學改變所有模型高脂喂養后，HE染色顯示A 組+B組腹主動脈內有明顯的AS斑塊形成，內膜增厚明顯且含有大量泡沫細胞，并形成了纖維帽，斑塊內可見膽固醇結晶，而進行C組+D組內皮細胞腫脹、變性減輕，且脂質沉積和泡沫細胞也減少。

2. 3各組免疫組化結果改變所有模型的AS斑塊內均發現很多棕黃色顆粒，且明顯聚集于斑塊肩部及基底部，而C組+D組棕黃色顆粒比A組+B組少。同時C組+D組AS斑塊內VEGF、FVⅢRAg、MMP-3和CD40L的陽性染色面積均比A組+ B組明顯減少(均P＜0. 01)。另外C組+D組MVB值明顯低于A組+B組(P＜0. 01)。見表1。

表1　各組斑塊組織免疫組化指標比較(x ±s，n=35)

2. 4斑塊超聲分子顯像EI與免疫組化法測定的MVD結果相關性分析8 w后，D組AS斑塊EI值與MVD值呈線性正相關(r= 0. 665，P＜0. 05)，而PI、AT、TTP值與MVD值均無相關性(r=0. 259，0. 088，－0. 112，均P＞0. 05); C組AS斑塊EI值與MVD值也呈線性正相關(r = 0. 401，P＜0. 01)，但相關性低于D組。

3　討論

AS是影響人類健康的主要疾病，絕大多數患者無任何前驅表現，常死于急性心血管事件。研究顯示，AS斑塊破裂和血栓形成是導致急性心血管病事件的主要原因，而斑塊的易損性及不穩定斑塊破裂是導致急性冠狀動脈綜合征的重要因素之一，及時判斷AS程度已成為預防事件發生的重點〔4〕。另外有研究顯示斑塊內大量新生血管的出現與斑塊的不穩定性密切相關〔5〕。他汀類藥物在降低冠心病的發病率和死亡率方面的意義非常大，其不僅能降低低密度脂蛋白膽固醇，還具有不依賴于降脂作用的心血管保護效應，如穩定易損斑塊、改善內皮功能、抗感染、抗氧化、免疫調節、降壓、抑制血栓形成等〔6〕。研究表明阿托伐他汀在抗AS的形成及發展方面具有非常重要的作用〔7〕。

MMPs是一組可消化細胞外基質的重要酶類，能降解纖維帽成分造成結構破壞，從而有助于促進斑塊破裂，是造成AS斑塊不穩定的主要原因〔8〕。而CD40L可表達于AS斑塊的內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞的表面，能夠誘導內皮細胞、單核/巨噬細胞及血管平滑肌細胞表達MMPs〔9〕。本研究結果提示阿托伐他汀具有抑制斑塊內CD40L的表達，進而降低MMP-3的表達，從而減少斑塊局部的基質降解，有助于保持斑塊的穩定性。而VEGF是一種生長因子，對血管內皮細胞的有絲分裂具有促進作用，研究證實其能明顯表達于在AS斑塊中，對斑塊的發生與發展可能有促進作用〔10〕。而FVⅢRAg是一種糖蛋白，可在內皮細胞表面廣泛表達，一般存在于小的毛細血管或毛細血管尚未形成管腔的分支，是新生血管內皮的特異性標志物〔11〕。VEGF和FVⅢRAg在血管形成過程起著非常重要的作用。本研究結果說明阿托伐他汀可一定程度抑制VEGF和FVⅢRAg在實驗兔AS斑塊模型中的表達，同時能降低斑塊內MVB值。另外病理形態觀察結果顯示，在高脂飲食的情況下，進行阿托伐他汀干預的模型其內膜內皮細胞腫脹、變性較未進行阿托伐他汀干預的模型減輕，且脂質沉積和泡沫細胞也減少，表明阿托伐他汀有助于改善內皮細胞功能，對AS斑塊的控制具有一定作用。

超聲造影可用來直觀AS斑塊內微血管分布情況，可用來評價AS斑塊穩定程度，超聲微泡造影劑是一種新型超聲造影劑，相對于常規造影劑具有更好的顯影效果。蛋白質、糖類、脂質等生物成分構成其外殼，而內部使用空氣或者惰性氣體進行填充，在人體注入后，周圍血液與微泡內氣體形成的界面可最大程度地將入射超聲(＞99%)反射回來，從而增強超聲反射信號的強度〔12〕。因為微泡的反射信號為非線性回聲，通過選擇性接收微泡的非線性回聲或抵消組織內的線性回聲，可使超聲顯像的對比度和分辨率明顯增強。本研究說明超聲微泡造影劑相對于常規超聲造影劑更有助于定量評價斑塊的增強情況，從而更有利于定量評價AS斑塊新生血管密度。

綜上所述，阿托伐他汀抑制斑塊內血管的新生可能是其穩定AS斑塊的機制之一。另外超聲微泡造影可定量測量斑塊EI，其與MVD具有良好相關性，可用于定量評價斑塊內MVD。

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〔2015-02-16修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目:新疆維吾爾自治區自然科學基金資助項目(No．2014211C124)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5717-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 015

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R743