脂聯素在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中的變化作用及分子機制

鄧應忠， 曹晨， 鄭興萍， 薛銳， 劉芳， 胡鄂曼， 譚啟榮

基礎與實驗研究

脂聯素在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中的變化作用及分子機制

鄧應忠， 曹晨， 鄭興萍， 薛銳， 劉芳， 胡鄂曼， 譚啟榮

目的： 通過建立大鼠糖尿病心肌缺血再灌注模型及缺血后處理模型，探討脂聯素在糖尿病心肌缺血再灌注損傷及缺血后處理中的變化及分子機制。

方法： 雄性SD大鼠80只，隨機分為6組：正常假手術組（n=8）、正常心肌缺血再灌注組（n=16）、正常缺血后處理組（n=16）、糖尿病假手術組（n=8）、糖尿病心肌缺血再灌注組（n=16）和糖尿病缺血后處理組（n=16）。腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立2型糖尿病模型， 缺血再灌注模型采用結扎左冠狀動脈前降支30 min再灌注120 min的方法建立； 缺血后處理于再灌注前給予3個循環再灌注10 s，缺血10 s的處理；假手術模型僅以絲線穿過冠狀動脈前降支但不結扎。再灌注120 min后處死大鼠，取心肌組織，三苯基氯化四氮唑法（TTC法）測定梗死面積；采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血漿中脂聯素的含量。免疫印跡方法（Western blot方法）測定心肌組織磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）和總蛋白激酶B（Total-Akt）表達。

結果： 與正常心肌缺血再灌注組比較，正常缺血后處理組心肌梗死面積顯著減?。≒＜0.05），而糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組的心肌梗死面積顯著增加（P＜0.01）；與正常假手術組比較，正常心肌缺血再灌注組和正常缺血后處理組血清脂聯素和p-Akt蛋白表達顯著上調（P＜0.05），糖尿病假手術組p-Akt蛋白表達顯著下調（P＜0.05）；與正常缺血后處理組比較，糖尿病假手術組、糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組脂聯素和p-Akt蛋白表達顯著下調（P＜0.05），差異均有統計學意義。線性相關分析顯示，血漿脂聯素的表達水平與心肌梗死面積呈負相關，而與心肌組織中p-Akt表達水平呈正相關，兩者的相關系數分別為0.63和0.65（P＜0. 01）。

結論：糖尿病血清脂聯素表達降低，可致磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路失活，導致糖尿病缺血再灌注損傷加重，缺血后處理不能實現對糖尿病心肌的保護作用。

脂聯素；糖尿??；缺血再灌注損傷；缺血后處理；心肌保護

Methods: A total of 80 male SD rats were randomly divided into 6 groups: Normal sham (NS) group, n=8, Normal ischemiareperfusion injury (NIRI) group, n=16, Normal ischemia post-conditioning (NIPO) group, n=16 and Diabetic mellitus sham (DMS) group, n=8, Diabetic mellitus ischemia-reperfusion injury (DMIRI) group, n=16, Diabetic mellitus ischemic post-conditioning (DMIPO) group, n=16. DM rats model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin; IR model was established by occlusion of left anterior descending (LAD) coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 120min; IPO model was established by 3 cycles of ischemia for 10s and reperfusion for10s; the rats in Sham group received silk line wrapping of LAD without occlusion. The myocardial infarction (MI) area was measured by TTC staining, plasma adiponectin level was examined by ELISA,

the protein expressions of p-Akt and total-Akt were detected by Western blot analysis.

Results: Compared with NIRI group, NIPO group had decreased MI area, P＜0.05, while DMIRI group and DMIPO group had increased MI area, P＜0.01; compared with NS group, NIRI group and NIPO group showed up-regulated expression of adiponectin and p-Akt, P＜0.05 and DMS group showed down-regulated p-Akt, P＜0.05. Compared with NIPO group, three DM groups presented down-regulated adiponectin and p-Akt, P＜0.05. Linear correlation analysis indicated that plasma adiponectin expression level was negatively related to MI area and positively related to myocardial tissue p-Akt expression with the correlation coefficient at 0.63 and 0.65 respectively, P＜0.01.

Conclusion: Down-regulated plasma adiponectin expression may cause the inactivation of PI3K/Akt signal pathway and therefore aggravate DM ischemia-reperfusion injury which cannot be protected by ischemic post-conditioning in experimental rats. Key words Adiponectin; Diabetes mellitus; Ischemia-reperfusion injury; Ischemic post-conditioning; Myocardial protection

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:879.)

近年研究表明中國糖尿病總體發病率約為11.6%，前驅糖尿病發病率為50.1%[1]，缺血性心臟病是糖尿病患者主要的心血管并發癥和首要致死原因[2]。糖尿病患者易患急性心肌梗死，表現為心肌梗死面積大、心臟衰竭重，病情重進展快、死亡率高[3]，經皮冠狀動脈擴張術或介入治療后效果較差，再次手術幾率高[4]，實施包括冠狀動脈搭橋術等圍術期并發癥的發生率高、預后差[2，5]。缺血后處理可持續緩解心肌缺血再灌注損傷，有效減小心肌梗死面積，不僅對動物心肌缺血再灌注損傷有保護作用，對人類心臟也有保護作用[6]，缺血后處理這一研究結論僅限于成人和動物模型，而對糖尿病心肌缺血再灌注損傷的保護作用減弱或消失，其機制尚未完全闡明。脂聯素在調節代謝、血管與心臟保護機制中發揮重要的作用。研究表明脂聯素基因敲除小鼠對心肌缺血再灌注損傷程度顯著增加，2型糖尿病患者血漿中脂聯素水平明顯降低，并且與缺血性心臟病呈負相關，提示脂聯素與糖尿病患者缺血性心臟病發生、發展密切相關。本實驗探討糖尿病心肌缺血再灌注損傷、缺血后處理過程中脂聯素的變化作用及可能信號機制。

1 材料和方法

試劑: 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）[7]測定脂聯素（試劑盒：上海美季生物有限公司），細胞裂解液（RIPA）（碧云天公司），苯甲基磺酰氟（PMSF）（科瑞生物），Cocktail蛋白酶抑制劑（美國羅氏公司），甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED（美國Sigma公司），過硫氨酸（AP）、Tris-base（國藥集團），蛋白激酶B（Akt）單克隆抗體（兔抗大鼠）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）單克隆抗體（兔抗大鼠）（美國Cell Signaling Technology公司），羊抗兔單克隆熒光二抗（美國LI-COR公司），BCA法蛋白定量試劑盒（碧云天公司）。

實驗動物及分組:2013-06至2014-03，采用健康成年雄性SD大鼠，體重220～250g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。野生型成年雄性SD大鼠隨機分為6組：正常假手術組（n=8）、正常心肌缺血再灌注組（n=16）、正常缺血后處理組（n=16）、糖尿病假手術組（n=8）、糖尿病心肌缺血再灌注組（n=16）和糖尿病缺血后處理組（n=16）。

動物模型的建立：（1）大鼠糖尿病模型的建立：將80 只健康雄性SD 大鼠，先喂以高脂高果糖飼料4 W，其中40只大鼠按照體重，以30 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）1次，2 W后誘導建立2型糖尿病模型[8]。其余40只大鼠，按照體重腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液。注射后繼續自由進食飲水，同時監測大鼠的飲食量、飲水量和尿量。72 h后當血糖濃度＞16.7 mmol/L并持續1 W以上時表示糖尿病鼠模型誘導成功。所有實驗在成模8 W后開始，實驗期間每周監測血糖水平、胰島素水平一次。（2）糖尿病心肌缺血再灌注損傷及缺血后處理模型的建立：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉并固定于實驗臺上，氣管插管連接小動物呼吸機。在大鼠四肢皮下及胸前插入針性電極，連接小動物心電圖儀。缺血再灌注模型建立如下：左側第四肋間開胸，剪開心包膜，充分暴露心臟。在左心耳的下緣處可以觀察到一白線狀血管，即為冠狀動脈左前降支,其剛好位于肺動脈圓錐下緣約2 mm處,用6～0帶線手術針進行穿線結扎，見心尖部位以及左心室前壁變白，心電圖可見ST 段即刻抬高, T波變高，提示結扎部位正確。結扎30 min后，松開結扎線恢復血流，可

觀察到左心室恢復紅潤，ST段回落。解除移液槍頭的套疊狀態即可恢復血供進行再灌注，再灌注的初期，從心電圖上可觀察到明顯的再灌注心律失常及ST段的下降回落，心尖部位和左心室前壁恢復紅色，若ST段15 min內下降50%則代表再灌注模型建立成功。正常心肌缺血再灌注組和糖尿病心肌缺血再灌注組在缺血30 min后，重新套疊移液槍頭又可結扎左前降支，并于再灌注前實施缺血后處理 （再灌注10 s，缺血10 s） 3個循環，再灌注120 min。

觀察指標及技術方法：（1）測量心肌缺血及心肌梗死面積：除正常假手術組、糖尿病假手術組外，其余各組隨機取8只大鼠心臟，于再灌注120 min時，經股靜脈注射1%Evans Blue 2 ml，取下心臟，置于-20℃ 30 min后，從心尖到心底縫線結扎部位分成三段，在中段同一平面垂直于長軸方向將其切成2 mm厚的薄片，置于l%三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液（Sigma公司，美國）中37℃孵育20 min。存活的心肌呈藍色，缺血區心肌呈磚紅色，梗死區心肌呈灰白色。采用Imag-Pro軟件（Media Cybemetics公司，美國）分析計算梗死心肌與全部左心室心肌面積比。各組取其平均值。（2）光鏡下觀察梗死區病理變化：取壞死部位心肌、固定液固定24 h、蘇木素伊紅（HE）染色法染色后。光學顯微鏡（×100）觀察各組小鼠心肌梗死區的變化。（3）血漿檢測指標：采用ELISA檢測血漿中脂聯素的含量。（4） 免疫印跡方法（Western blot方法）分析心肌組織p-Akt和總蛋白激酶B（Total-Akt）水平：每組大鼠自前降支結扎線以下心尖部取左心室缺血心肌組織100 mg，加入1 000 μl RIPA裂解液，及蛋白含量測定、SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、顯影等操作。Odyssey紅外掃描顯影儀掃描熒光條帶，Quantity one軟件進行灰度測量，以目的蛋白與內參蛋白的灰度比值作為蛋白相對表達量。

2 結果

心肌缺血面積和梗死面積比較（表1）：與正常心肌缺血再灌注組比較，正常缺血后處理組梗死面積顯著降低， 糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組梗死面積顯著增大，差異有統計學意義（P＜0.05～0.01）；與糖尿病心肌缺血再灌注組相比，糖尿病缺血后處理組的心肌梗死面積無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心肌缺血面積和梗死面積的比較

表1 各組大鼠心肌缺血面積和梗死面積的比較

注：與正常心肌缺血再灌注組比較*P＜0.05**P＜0.01

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光鏡下心肌結構的變化（圖1）：糖尿病假手術組，心肌纖維排列整齊有序，未見斷裂、變性壞死等改變，間質無炎細胞浸潤。糖尿病心肌缺血再灌注組及正常心肌缺血再灌注組心肌纖維排列紊亂、凝固性壞死、核脆裂、核消失，胞質均質紅染或不規則粗顆粒狀，間質水腫，少量中性粒細胞浸潤。糖尿病缺血后處理組與糖尿病心肌缺血再灌注組比較無改善，正常缺血后處理組與正常心肌缺血再灌注組比較心肌纖維排列較整齊，斷裂、變性壞死程度輕。

圖1 各組大鼠心肌組織鏡下觀（HE染色，×100）

各組大鼠血漿脂聯素及心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達（圖2、表2）：與正常假手術組比較：正常心肌缺血再灌注組和正常缺血后處理組血清脂聯素和p-Akt蛋白表達顯著上調（P＜0.01～0.05）；糖尿病假手術組p-Akt蛋白表達顯著下調（P＜0.05）；其余各組脂聯素及p-Akt蛋白表達下調，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常缺血后處理組比較：糖尿病假手術組、糖尿病心肌缺血再灌注組及糖尿病缺血后處理組脂聯素和p-Akt蛋白表達下調（P＜0.01～0.05）。血漿脂聯素的表達水平與心肌梗死面積呈負相關，而與心肌組織中p-Akt表達水平呈正相關，兩者的相關系數分別為0.63和0.65，P＜0. 01，差異有統計學意義。

圖2 各組大鼠心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達的免疫印跡圖

表2 各組大鼠血漿脂聯素及心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達比較

表2 各組大鼠血漿脂聯素及心肌組織p-Akt和Total-Akt蛋白表達比較

注： 與正常假手術組比較*P＜0.05**P＜0.01；與正常缺血后處理組比較△P＜0.05△△P＜0.01。余注見圖2

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3 討論

脂聯素是Scherer等[9]于1995年從鼠的脂肪細胞中克隆出的一種新cDNA，近十年的實驗與臨床發現脂聯素主要有三種生物學功能：胰島素增敏/代謝調節功能（主要是肝臟和肌肉）；抗炎/血管保護功能；抗缺血心肌保護功能[10]。脂聯素高表達，通過對巨噬細胞抗炎表型激活（或活化）的抑制作用，可以制止代謝和心血管疾病惡化[11]。大量流行病學調查顯示伴有高血糖的肥胖和糖尿病患者中，脂聯素水平越低，其患心血管疾病風險越高。血漿脂聯素濃度與胰島素水平負相關。脂聯素表達分泌受體內一些炎癥因子、轉錄因子、激素等因素調節，如炎癥因子TNF-α、IL-6等炎癥介質抑制脂聯素的表達分泌，其中TNF-α可通過強烈抑制脂聯素啟動子的活性而發揮作用。在肥胖狀態大多數脂肪因子是上調的，通常充當前炎癥介質促進疾病過程。相反，脂聯素因肥胖而下調[12]。Walsh等證實脂聯素敲除小鼠對心肌缺血再灌注損傷易感性增加，并且在再灌注前給予脂聯素的重組體，可以顯著減少心肌梗死面積[13，14]。這些結果提示在Ⅱ型糖尿病患者中，脂聯素水平降低，不僅促進了缺血性心肌病的發生，還加重了缺血再灌注后心肌細胞死亡。本研究結果缺血再灌注尤其是缺血后處理引起脂聯素顯著升高，可以顯著減少心肌梗死面積；而糖尿病心肌中，脂聯素表達受到抑制，且缺血再灌注與缺血后處理均不能上調其表達水平，心肌梗死面積增大。提示糖尿病患者合并急性心肌梗死不能通過缺血后處理減少心肌梗死面積，相反是擴大心肌梗死面積，惡化預后。

磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號轉導通路是維持細胞周期運行，抑制細胞凋亡，促進細胞生長增殖的重要因素。在心肌細胞中PI3K/Akt通路的激活可減輕胞內鈣超載，維持線粒體膜穩定性，防止因線粒體膜通道孔（線粒體mPTP）的開放而導致的后續氧化損傷和凋亡反應，是心肌細胞重要的內源性抗氧化防御機制[15]。而缺血后處理作為重要的機體內源性保護措施，可通過PI3K/Akt通路激活發揮保護作用。高妮妮等[16]證實PI3K-AkteNOS信號通路在三磷酸腺苷后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷。研究發現糖尿病心肌缺血再灌注損傷后缺血后處理的保護作用消失，進一步研究顯示缺血后處理保護作用消失的機制與PI3K/Akt通路失活密切相關[17,18]。Wang等[19]證實N-乙酰半胱氨酸和別嘌呤醇協同減弱糖尿病大鼠缺血再灌注損傷機制通過脂聯素上調PI3K/Akt通路而實現。

本實驗證實正常大鼠心肌缺血再灌注及缺血后處理后心肌梗死面積逐漸減小，心肌損傷壞死程度顯著減輕，脂聯素表達及p-Akt表達依次增高；而在糖尿病大鼠脂聯素表達及p-Akt表達降低，且缺血再灌注、缺血后處理均不能上調脂聯素表達，相

關p-Akt表達亦降低，在脂聯素的低表達及PI3K/ Akt通路失活作用下，增加了糖尿病心肌對缺血的敏感性，與Christopher等[20]研究結果相似，表明糖尿病缺血再灌注損傷加重不能通過缺血后處理實現對糖尿病心肌缺血的保護作用。本研究結果表明在正常心肌缺血再灌注及缺血后處理引起脂聯素升高且伴隨著p-Akt表達的升高，脂聯素與p-Akt的表達呈顯著正相關。而糖尿病心肌中脂聯素表達受到抑制，且缺血再灌注損傷與缺血后處理均不能上調其表達，p-Akt的低表達使其無法通過調節PI3K/ Akt信號通路而發揮保護作用。在糖尿病合并急性心肌梗死行冠狀動脈球囊擴張及支架術缺血再灌注時，實施缺血后處理不能實現心肌保護作用。

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Effect of Adiponectin Levels With its Related Mechanism on Diabetic Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Experimental Rats

DENG Ying-zhong, CAO Chen, ZHENG Xing-ping, XUE Rui, LIU Fang, HU Er-man, TAN qi-rong.
Department of Cardiology, The Third Hospital of Wuhan City, Wuhan (430074), Hubei, China

Objective: To investigate the effect of adiponectin levels with its related mechanism in diabetic myocardial ischemia-reperfusion injury and ischemia post-conditioning in experimental rats.

2014-10-28）

（編輯：汪碧蓉）

武漢市臨床醫學科研項目（WX12D11）

430074 湖北省，武漢市第三醫院 心內科（鄧應忠、 曹晨 、鄭興萍 、 劉芳、胡鄂曼、譚啟榮）；武漢大學人民醫院（薛銳）

鄧應忠 副主任醫師 學士 研究方向為心血管病研究 Email：dggxxmm@126.com 通訊作者：曹晨 Email：807439737@qq.com

R332

A

1000-3614（2015）09-0879-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.09.014