一株珙桐耐鉛、鎘內生真菌的分離鑒定及生物學特性分析*

方志榮

(西昌學院，四川 西昌 615013)

一株珙桐耐鉛、鎘內生真菌的分離鑒定及生物學特性分析*

方志榮

(西昌學院，四川 西昌 615013)

從珙桐2年生健康實生苗的莖段中分離到一株耐鉛、鎘內生真菌。經形態(tài)學觀察，該菌初步鑒定為鏈格孢屬真菌。該菌的最佳培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。溫度、pH、碳源和氮源對其生長有一定影響。在溫度為15～35℃時均能生長，最適溫度為25～30℃。該菌能適應較寬的pH值范圍，在pH值5～9的條件下生長旺盛。多種碳源和氮源均能促進該菌生長，最佳的碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、甘露糖和蔗糖，最佳的氮源為硝酸鈉。該菌能在含1 000 mg/L Pb(NO2)2或100 mg/L CdCl2．2．5H2O培養(yǎng)基上生長，表明該菌在鉛、鎘脅迫下仍有較強的生長能力。

珙桐；內生真菌；鏈格孢屬；生物學特性；鉛脅迫；鎘脅迫

土壤是一種極為重要、富有生命的資源。然而，近幾十年來，隨著我國工農業(yè)的迅速發(fā)展，大量廢棄物的排放、農藥和化肥的使用，加上日益劇增的城市生活垃圾，使土壤遭到了嚴重的重金屬污染，其中鉛和鎘因為毒性大而受到多方關注,具體表現(xiàn)為極強的積累性和不可逆性[1]。重金屬污染防治已成為亟待解決的問題[2]。利用重金屬超富集植物吸附土壤重金屬的植物修復作為生物修復的方法之一，具有成本低，修復徹底、無二次污染等優(yōu)點。然而植物修復也存在一些不足，如植物生長速度慢、生物量小等缺點[3]。重金屬污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復是一種生物修復的有效措施[4]。目前該類研究主要采用根際微生物與宿主植物建立修復系統(tǒng)，但根際微生物在實際應用中往往不適應多變的土壤環(huán)境或受到土著微生物的競爭，效果不顯著[5]。

植物的內生真菌(endophyte)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織內部或細胞間隙、不引起植物產生明顯病癥的一類真菌[6]。內生真菌在長期的進化過程中，與宿主形成了互利共生的關系。一方面，內生真菌從宿主吸收營養(yǎng)供自己生長需要；另一方面內生真菌產生的某些次生代謝產物對植物具有促生長、抗病蟲害、抗逆境（如干旱等）以及他感等作用[7]。因此利用內生真菌構建植物-微生物聯(lián)合修復系統(tǒng)修復重金屬污染的土壤，不僅可以克服單獨微生物修復中微生物難存活的缺點，還可以增加植物修復的效果，具有廣闊的應用前景[8-9]。

珙桐(Davadia involucrata Baill)在晚白堊紀和第三紀時期曾廣泛分布于世界許多地區(qū),但是由于第四紀冰川的影響,僅在我國西南地區(qū)受冰川活動影響小的地方存活下來,為第三紀孑遺植物[10]。有關珙桐植株內生真菌的研究已有相關的報道。何映霞等[11]從珙桐中分離到一株產黃酮內生真菌Aspergillus fumigatus。張亮等[12]發(fā)現(xiàn)珙桐內生真菌Lophiostoma sp.的主要產物是萜類和脂肪酸的衍生物為主。然而，能助珙桐抗逆境的內生真菌迄今為止尚無報道。本研究以珙桐兩年生實生苗為材料，分離、篩選出鉛、鎘的耐受菌，并對其鉛、鎘耐受性進行研究，旨在為構建鉛、鎘超富集植物-微生物修復系統(tǒng)提供菌種，為珙桐等珍稀野生植物資源的保護和開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

珙桐2年生健康實生苗于2013年5月從云南省大理市喜洲鎮(zhèn)周城蒼泉植物園購買。實驗前將其剪成2 cm長的莖段、根進行表面沖洗、消毒后，馬上進行內生菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）分離純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g,純化水1 000 mL。

（2）篩選培養(yǎng)基：以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入50 mg/L的CdCl2.2.5H2O和500 mg/L的Pb(NO2)2。

（3）鑒別培養(yǎng)基：馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（Potato Carrot Agar，PCA）：馬鈴薯200 g，胡蘿卜25 g，瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL。

（4）生物學特性研究培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)基(Czapek Agar,CA)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（Potato Sugar Agar，PSA）、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）[13]。

（5）脅迫培養(yǎng)基：以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,添加Pb(NO2)2或CdCl2，均為分析純。培養(yǎng)基鉛的濃度梯度為250、500、750、1 000 mg/L(以Pb(NO2)2計)，鎘的濃度為25、50、75、100 mg/L(以CdCl2.2.5H2O計)。

1.2 方法

1.2.1 分離、純化、鑒定

（1）分離培養(yǎng)經自來水沖洗的試驗材料用0.5%升汞浸泡3 min，用無菌水漂洗4次，再用75%的乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗數(shù)次[14]。把處理過的材料置于PDA培養(yǎng)基上，30℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)10 d。實驗共設2個空白對照。最后一次漂洗液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上作為對照。將表面滅菌處理的莖段、根壓入PDA培養(yǎng)基平板內，使表面滅菌材料與PDA培養(yǎng)基接觸2 min，移去滅菌植物材料作為另一對照[15]。

（2）純化待組織塊下或邊緣的培養(yǎng)基上長出菌落后，采用劃線稀釋法進行菌種的分離純化。

（3）篩選將純化后的菌接種在篩選培養(yǎng)基上，30℃黑暗培養(yǎng)5 d。

（4）內生菌的鑒定將篩選到的菌株接種于PCA培養(yǎng)基上，30℃黑暗培養(yǎng)5 d。從菌落特征、孢子形態(tài)特征等對分離菌株進行鑒定。

1.2.2 生物學特性分析

參照鄭文龍[13]的方法。

（1）不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

試驗前，用PDA培養(yǎng)基活化菌種，待該菌達到較好生長狀態(tài)后統(tǒng)一用直徑為0.7 cm的打孔器打孔。將直徑為0.7 cm的供試菌塊接種到各培養(yǎng)基的中央部位，每皿1個，每處理3皿，放入30℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，4 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

（2）不同pH和培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響

pH：制備pH為3、4、5、6、7、8、9共6個梯度的查氏培養(yǎng)基，接入菌塊后，培養(yǎng)條件和調查記載同（1）。

培養(yǎng)溫度：將直徑為0.7 cm的菌塊接種于查氏培養(yǎng)基上，分別置于10、15、20、25、3O、35℃生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，調查記載同（1）。

（3）不同碳、氮源對菌絲生長的影響

碳源的篩選：選用查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以供試碳源替換其中的蔗糖。供試碳源為乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、糊精、可溶性淀粉共5個處理，以不加碳源的CA培養(yǎng)基為對照(ck)，接入菌塊，培養(yǎng)條件和調查記載同（1）。

氮源的篩選：選用查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以供試氮源替換其中的NaNO3。供試氮源為硝酸鉀、硝酸鈣、硝酸銨、蛋白胨、尿素共5個處理，以不加氮源的CA培養(yǎng)基為對照(ck)，接入菌塊，培養(yǎng)條件和調查記載同（1）。

1.2.3 脅迫培養(yǎng)

將直徑為0.7 cm的菌塊接種于脅迫培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件和調查記載同（1）。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和單因素的方差分析。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)描述

本實驗從珙桐的莖段和根中共分離到43株菌，通過篩選培養(yǎng)基篩選出鉛、鎘的耐性菌3株（其中2株為酵母菌）。該菌株來源于珙桐的莖段。根據(jù)預實驗的結果，該菌株可能是鏈格孢屬。為進一步驗證結果，將該菌株重新接種到PCA培養(yǎng)基上，30℃下暗培養(yǎng)5 d。該菌株在PCA培養(yǎng)基上菌落暗黑色，緊貼培養(yǎng)基表面生長。分生孢子梗顏色深，直或立，分枝或不分枝。成熟分生孢子淡褐色至褐色，倒棒狀、近球形或廣橢圓形，具橫隔膜1～5個，縱隔膜0～2個，黑褐色（圖1）。根據(jù)菌落特征和分生孢子形態(tài)確定該菌株為鏈格孢屬Alternaria sp.[16]。

圖1 顯微鏡下分生孢子的形態(tài)（25×）

2.2 菌株生物學特性

2.2.1 pH值、溫度對菌株生長的影響

查氏培養(yǎng)基平板上鏈格孢能適應較寬的pH值范圍，pH值為3.0和4.0時菌絲生長緩慢，pH值為5.0～9.0時菌絲生長緩慢。pH值為7.0最有利于菌絲的生長，但是未與pH值為5.0、6.0、8.0和9.0時表現(xiàn)出明顯的差異（圖2），不同培養(yǎng)溫度對查氏培養(yǎng)基平板上鏈格孢菌絲生長影響差異顯著。該鏈格孢菌在10～35℃均可生長，在25～30℃菌絲生長旺盛，其中以25℃溫度為菌絲生長的最適溫度（圖3）。

圖2 pH值對鏈格孢菌生長的影響

圖3 溫度對鏈格孢菌生長的影響

2.2.3 培養(yǎng)基種類對菌株生長的影響

不同培養(yǎng)基上鏈格孢菌絲生長有一定的影響，4種培養(yǎng)基中，PDA培養(yǎng)基最有利于菌絲的生長，其次是查氏培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基上長勢最差（圖4）。

圖4 培養(yǎng)基種類對鏈格孢菌生長的影響

2.2.4 不同氮源、碳源對菌株生長的影響

該鏈格孢菌絲在供試氮源上均能良好生長，供試氮源與對照存在極顯著差異。實驗結果表明，硝酸鈉組菌落直徑最大，硝酸鈣和蛋白胨次之，以硝酸銨和尿素為氮源時生長最慢（圖5）。所有供試碳源均有利于該鏈格孢菌絲體生長，在以葡萄糖、淀粉、甘露糖和蔗糖為碳源的查氏培養(yǎng)基平板上生長最快，糊精和果糖次之。

圖5 氮源對鏈格孢菌生長的影響

圖6 碳源對鏈格孢菌生長的影響

2.3 菌株對鉛、鎘的耐受性

隨著鉛濃度的增加，鉛脅迫對鏈格孢菌的生長表現(xiàn)出抑制作用，但是仍能生長。當鉛的濃度為250、500、750、1 000 mg/L時，鏈格孢菌相對生長速率分別為對照的78%、69%、57%、51%（圖7）。隨著鎘濃度的增加，鎘脅迫對鏈格孢菌的生長表現(xiàn)出抑制作用，但是仍能生長。當鎘的濃度為25、50、75、100 mg/L時，鏈格孢菌相對生長速率分別為對照的89%、73%、66%、59%（圖8）。

圖7 鉛脅迫對鏈格孢菌生長的影響

圖8 鎘脅迫對鏈格孢菌生長的影響

3 結論與討論

本實驗從珙桐2年生健康實生苗的莖段分離到了一株耐鉛、鎘的內生真菌。經鑒定，確定該菌株為鏈格孢屬真菌。該菌株在溫度為15～35℃時均能生長，最適溫度為25～30℃。該菌能適應較寬的pH值范圍，在pH值5～9的條件下生長旺盛。多種碳源和氮源均能促進鏈格孢生長，最佳碳源為葡萄糖、淀粉、甘露糖和蔗糖；最佳的氮源為硝酸鈉。該菌能在含1 000 mg/L Pb(NO2)2或100 mg/L CdCl2.2.5H2O培養(yǎng)基上生長。這說明該菌在鉛、鎘脅迫下仍有較強的生長能力。

宋益民等[17]發(fā)現(xiàn)銀杏鏈格孢菌在pH為9～12時，96 h前菌絲生長緩慢，96 h后生長迅速增加，推測鏈格孢在生長過程中可能產生酸性代謝物。王娜等[18]發(fā)現(xiàn)了一株鏈格孢真菌菌絲醇提取物對植物生長具有明顯的促進作用，并對其真菌培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。趙明治等[19]從極細鏈格孢菌JH505菌株中分離純化出一種35KD植物激發(fā)分子，該純化蛋白能提高小麥根系琥珀酸脫氫酶活性、促進小麥根的生長。這說明珙桐鏈格孢內生真菌可能對植物生長具有促進作用，具體的促進作用還需要進一步的試驗進行驗證。目前已發(fā)現(xiàn)500多種鏈格孢屬真菌，大部分屬于病原菌。該屬菌適應性強，95%以上的種能兼性寄生于植物上[20]。本實驗分離純化的珙桐鏈格孢屬內生真菌尚未發(fā)現(xiàn)其致病性，因而可能作為一種鉛、鎘的耐受菌構建鉛、鎘超富集植物-鏈格孢菌的修復系統(tǒng)。

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Isolation,Identification of a Endophytic Fungus With Lead and Cadmium Tolerance from Davidia Involucrata Baill and Its Biological Characteristics

FANG Zhi-rong
(Xichang College,Xichang,Sichuan 615013)

A endophytic fungus with lead and cadmium tolerance was isolated from the two-year-old healthy Davidia involucrate stem.It was initially identified as Alternaria sp.According to the characteristics of morphology,the optimal medium was PDA for the growth of the fungus.Temperature,pH,nitrogen sources and carbon sources affected the growth of the fungus.The fungus could grow at 15～35℃.The optimal growth temperature was 25～35℃. It was adaptable to the properties in a broader pH value range.It could grow well between pH 5.0 and pH 9.0.Many carbon sources and nitrogen sources tested could obviously make the fungus grow.The best carbon source was glucose,soluble starch,mannose or sugar.The best nitrogen source was sodium nitrate.It could grow on the Czapek Agar with a concentration of 1 000 mg/L Pb(NO2)2or 100 mg/L CdCl2.2.5H2O.The results showed that the fungus had stronger adaptability under lead stress and cadmium stress.

Davidia involucrate;endophytic fungus;Alternaria sp.;biological characteristics;lead stress; cadmium stress

S792.99；Q949.9

A

1673-1891（2015）04-0001-04

2015-08-11

四川省教育廳項目（08zb015）；西昌學院自立項目（ZZSSA0808）。

方志榮(1981-)，女，講師，在讀博士，研究方向：植物學。