培養條件對毛霉胞內代謝產物穩定性的影響研究

史碧波

（西昌學院 輕化工程學院，四川 西昌 615013）

培養條件對毛霉胞內代謝產物穩定性的影響研究

史碧波

（西昌學院 輕化工程學院，四川 西昌 615013）

試驗初步探討了毛霉培養條件對其胞內代謝產物穩定性的影響。以單一菌株為研究對象，探討了培養基、接種量、培養時間、培養溫度、搖瓶速度等因素對菌株胞內代謝產物HPLC圖譜的影響，分析各因素的影響大小，建立了規范化的培養流程：選用馬鈴薯制作馬鈴薯葡萄糖培養基，按每支18×180 mm試管裝載30 mL進行分裝，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，在溫度設為20℃的恒溫搖床中以150 r/min搖瓶速度搖瓶培養4 d后取出。

毛霉；培養條件；胞內代謝產物；高效液相色譜；中藥色譜指紋圖譜；相似度評價系統

0 引言

毛霉（Mucor spp.）是我國食品加工或化工生產中常利用的一類陸生真菌，但其中的某些種可能產生毒素，某些種是引起腐敗或感染致病的微生物[1]，所以，從分類上弄清毛霉的種類，即準確的分類鑒定對更好利用毛霉或規避毛霉的危害至關重要。傳統的毛霉分類鑒定方法是形態學結合生理生化特征[2]，但該方法不易掌握，很多有經驗的微生物學家也有可能作出錯誤的分類鑒定結果。另一種目前常采用的方法是DNA分子鑒定，但目前對毛霉的分子鑒定還未找到最為合適的分類標記，目前最常用的ITS序列不能對多種毛霉進行分類鑒定[3]。我們想探索HPLC檢測毛霉菌絲提取物用于分類鑒定的可行性，為毛霉分類鑒定提供一種新的方法。高效液相色譜是現代較為成熟的一種分析檢測手段，在中草藥的分類及品質鑒定方面有眾多報道[4]，在微生物的分類鑒定方面也有一些報道，如利用高效液相色譜檢測細菌DNA的G+C含量、枝菌酸分析、醌類測定和多胺分析，從而達到對細菌進行分類鑒定的目的[5]。我們設想將毛霉中的化學物質提取出來，進行HPLC檢測，通過圖譜的相似程度或者差異程度來判斷是否是一種毛霉。這種方法可行的前提之一是在標準化培養過程中毛霉的代謝產物較為穩定。本文主要探討培養條件，如不同培養基、不同接種量、不同搖瓶速度、不同培養溫度、不同培養時間等條件對毛霉胞內代謝產物穩定性的影響，旨在建立規范化的培養條件，減少培養條件對檢測結果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

毛霉菌株：Mucor circinelloides f.circinelloides，編號為CGMCC 3.4916，購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗試劑

（1）蛋白胨葡萄糖培養基：稱取蛋白胨4 g/L，葡萄糖20 g/L，溶解后分裝，用高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后待用。

（2）馬鈴薯葡萄糖培養基：稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊放入1 000 mL水中煮20～30 min，用8層紗布過濾，取其濾液，加20 g葡萄糖溶解，定容至1 000 mL，分裝，用高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后待用。

（3）流動相制備：檢測時所用流動相為pH4.0的甲酸水溶液和色譜純乙腈。流動相均經過0.45μm濾膜過濾。

（4）提取溶劑制備：提取溶劑為50%甲醇溶液。

1.3 試驗儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國Agilent公司；手提式高壓殺菌鍋：鄭州杜甫儀器廠；VC-S-1040超凈工作臺：北京嘉創博遠凈化科技有限公司；SHA-CII水浴恒溫培養搖床：金壇市華城開元實驗儀器廠；ESJ200-4電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；SHZ-D循環水式真空泵：臺州市博奧真空設備有限公司；JP-C100型超聲波振蕩清洗儀：廣州吉普超聲波電子設備有限公司。

1.4 方法

將編號為CGMCC 3.4916的毛霉菌株分別在不同條件下培養獲得菌絲，經處理檢測后用于毛霉胞內代謝產物穩定性分析。

將保藏菌株用無菌水配制成為1萬個/mL的孢子懸液，然后接種到經滅菌的培養基中按各種培養條件進行培養，一定時間后取出。將培養物過濾，用無菌水洗滌菌絲，用無菌濾紙吸干菌絲表面水分，用液氮冷凍研磨成菌絲粉末。按質量體積比10∶1(mg∶mL)的比例稱量菌絲粉末和提取溶劑到可密封的小玻璃瓶中，在30℃恒溫條件下超聲提取3 h后取出，用0.45μm的濾膜過濾待測。檢測時采用配備紫外檢測器的高效液相色譜儀，色譜條件為：Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱（4.6×150 mm，5μm）；流動相流速0.6 mL/min；流動相為pH4.0的甲酸水溶液和乙腈進行洗脫，洗脫程序為：0 min：100%水（pH4.0）；30 min∶5%水（pH4.0），95%乙腈；60 min∶5%水（pH4.0），95%乙腈；色譜柱溫度35℃；檢測波長215.5 nm；進樣20μL。檢測后的圖譜用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”進行匹配[13]，計算相似度，比較分析各培養條件對毛霉胞內代謝產物穩定性的影響。

1.5 數據分析方法

在高效液相色譜配備的化學工作站軟件中對所得圖譜進行積分，導出為AIA格式，然后將AIA格式的HPLC圖譜導入“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”，該軟件可以對圖譜進行匹配，得到各圖譜在色譜峰的保留時間、峰面積上的匹配結果，進一步得到各圖譜的相似度[6]。根據所得相似度進行圖譜間的差異分析。

2 結果與分析

2.1 培養基對圖譜的影響

選擇不同地方購買或不同品種的馬鈴薯，蛋白胨選擇不同廠家或不同批次產品，分別制作3個批次的馬鈴薯葡萄糖培養基和蛋白胨葡萄糖培養基，按每支18×180 mm試管裝載30 mL進行分裝，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，在同一搖床中（20℃）搖瓶培養5 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進行處理檢測，圖譜如圖1所示。圖譜相似度結果如表1所示。

圖1 不同培養基的HPLC圖譜

表1 不同培養基的HPLC圖譜相似度

從圖1可以很直觀地看出，馬鈴薯葡萄糖培養基與蛋白胨葡萄糖培養基的菌絲提取物間存在明顯的差異，表1的數據中二者之間的相似度在0.003～0.016之間，相似度非常小，這表明，如果是用2種不同的培養基培養所得的菌絲提取物則沒有可比性，所以我們在進行HPLC檢測菌絲提取物時一定要保證所比較的菌絲提取物都是使用一種培養基進行培養而得。

那么，究竟選擇哪一類培養基進行培養更為恰當，這要從2類培養基中的組內差異來分析。不同馬鈴薯培養基培養物的相似度在0.720～0.941之間，相似度較大，表明用馬鈴薯培養基來培養的毛霉胞內代謝產物的穩定性較好；3種蛋白胨培養基培養物的相似度在0.168～0.428之間，表明不同蛋白胨培養的毛霉胞內代謝產物的穩定性較差。所以，相對于蛋白胨葡萄糖培養基而言，選擇馬鈴薯葡萄糖培養基更有利于減少培養基對毛霉胞內代謝產物的影響。這個結果也反映了標準化的培養基對微生物代謝穩定性的重要作用。

2.2 培養溫度對圖譜的影響

配制馬鈴薯葡萄糖培養基，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，分別放在10、20、30℃的搖床中，搖瓶培養5 d，取出后分離出菌絲，處理提取后上HPLC檢測，比較圖譜，分析培養溫度對毛霉胞內代謝產物穩定性影響。經分析軟件得相應圖譜的相似度，見表2。

表2 不同溫度的HPLC圖譜相似度

由表2可以看出相同溫度條件下毛霉胞內代謝產物較為穩定，相似度在0.897～0.983之間，其中以20℃條件下最大。不同培養溫度條件下毛霉胞內代謝產物變化較大，相似度在0.240～0.753之間，表明培養溫度對圖譜的影響較大。其中，培養溫度為10℃與20℃的相似度為0.724～0.753，圖譜相似度較大，表明在10～20℃之間培養的毛霉代謝物較穩定；20℃與30℃的相似度為0.320～0.342，表明在20℃～30℃之間培養的毛霉代謝物不穩定，這可能是因為毛霉多屬于低溫品種，其適宜生長溫度一般在25℃以下，溫度過高其生長和代謝出現異常所致。所以，我們選擇培養溫度在20℃進行規范操作，以盡量減小培養溫度對圖譜的影響。

2.3 接種量對圖譜的影響

配制馬鈴薯葡萄糖培養基，滅菌后分別接入1、2、3、4、5 mL的同批次毛霉孢子懸液，在同一個搖床內（20℃）搖瓶培養5 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進行處理檢測，分析接種量對毛霉胞內代謝產物穩定性影響。經分析軟件得相應圖譜的相似度，見表3。

表3 不同接種量的HPLC圖譜相似度

由表3看出相同接種量條件下毛霉胞內代謝產物較為穩定，相似度在0.962～0.986之間，其中以2%接種量條件下最大。不同的接種量之間的相似度在0.338～0.843之間，說明接種量對毛霉胞內代謝產物的影響較大。表中2 mL接種量與1 mL接種量、3 mL接種量的圖譜相似度都較大，所以我們選擇接種2 mL進行規范操作，以便在接種量略有偏差時對圖譜影響可以降到最低。

2.4 培養時間對圖譜的影響

配制蛋白胨葡萄糖培養基，滅菌后接入2mL的毛霉孢子懸液，在同一個搖床內分別搖瓶培養3、4、5、6、7 d后取出分離出菌絲，經HPLC檢測，比較圖譜，分析培養時間對毛霉胞內代謝產物穩定性影響。經分析軟件得相應圖譜的相似度，見表4。

由表4可以看出相同培養時間的毛霉胞內代謝產物較為穩定，相似度在0.965～0.993之間，其中以培養4 d條件下最大。不同的培養時間相似度在0.218～0.917之間，相似度差距較大，表明培養時間對圖譜的影響較大，說明培養時間對毛霉胞內代謝產物的穩定性影響較大。其中，培養3～5 d的圖譜相似度在0.824～0.917之間，這說明培養3～5 d的菌絲代謝物較為穩定；而培養6 d、7 d的圖譜相似度降低很多，可能是由于菌絲老化，其代謝物發生較大變化所致。所以，我們選擇培養4 d進行規范操作，以盡量減小培養時間對圖譜的影響。

表4 培養時間的HPLC圖譜相似度

2.5 搖瓶速度對圖譜的影響

配制蛋白胨葡萄糖培養基，滅菌后接入2 mL毛霉孢子懸液，在20℃恒溫器中分別在靜置狀態、100、150、200 r/min搖瓶培養4 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進行處理檢測，分析搖瓶速度對毛霉胞內代謝產物穩定性影響。經分析軟件得相應圖譜的相似度，見表5。

表5 不同搖瓶速度的HPLC圖譜相似度

由表5可以看出，在其它培養條件相同而搖床轉速不同的情況下，圖譜相似度在0.906～0.974之間，說明搖床轉速對毛霉胞內代謝產物的影響不大，在培養過程中不用特別在意搖床轉速。雖然靜止培養的圖譜與其它相似度也不錯，但相差略大，而且靜止培養會使毛霉只在表面生長，所以我們的規范化操作還是確定在搖床中進行，控制轉速在150r/min左右即可。

3 結論和討論

試驗探討了培養過程中不同培養基、接種量、培養時間、培養溫度、搖瓶速度等因素對毛霉胞內代謝產物HPLC圖譜的影響，根據圖譜的相似度差異確定應該采取的規范化培養操作如下：可選用馬鈴薯制作馬鈴薯葡萄糖培養基，按每支18×180 mm試管裝載30 mL進行分裝，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，在溫度設為20℃的搖床中以150 r/min搖瓶速度搖瓶培養4 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進行處理檢測。

在對菌株進行規范化培養中，可明確看出選用哪種培養基是最為重要的，雖然在試驗比較中顯示了馬鈴薯葡萄培養基培養的毛霉菌絲比蛋白胨葡萄糖培養基培養的毛霉菌絲有更穩定的代謝產物，但是馬鈴薯畢竟有很多不同的品種，其成分也有較大差異，可能在各地制備的馬鈴薯葡萄糖培養基就會體現出較大差異，這對保證代謝產物穩定不利。所以，標準化的培養基研制是必要的工作。

注釋及參考文獻：

[1]羅曉妙，高玉強．高產胞外蛋白酶毛霉的篩選及酶學性質研究[J]．西昌學院學報（自然科學版）,2014(12):2．

[2]廖永紅,任文雅,伍松陵，等．兩株酒曲毛霉的分離及Biolog微生物系統分析鑒定[J]．食品工業科技,2010(1):191-193．

[3]Walther G．,Pawlowska J，Alastruey-lzquierdo A，et al．DNA barcoding in Mucorales:an inventory of biodiversity．Persoonia, 2013(30)：11-47．

[4]中藥指紋圖譜研究技術[M]．北京：化學工業出版社，2002．

[5]姜遠良．化學分類法在細菌和真菌系統分類學中的應用和發展[J]．遼寧師范大學學報(自然科學版),1995(2):152-155．

[6]謝培山．中藥色譜指紋圖譜[M]．北京：人民衛生出版社．2005．

Effect of Culture Conditions on the Stability of Mucor Intracellular Metabolites

SHI Bi-bo
(School of Applied and Chemical Engineering,Xichang College,Xichang,Sichuan 615013)

The influence of culture conditions on Mucor intracellular metabolites stability was investigated in this paper.A Mucor strain was cultured in different medium,by different inoculation volume,for different culture time,at different culture temperature and different shaking speed,and then the cultures were detected on HPLC after extracting by 50%methanol solution.Through analysis of HPLC fingerprints,the standardized training process was established∶potato dextrose was chose to be the medium,and the medium was packed to 18 x 180 mm test tube (30mL/tube).2 mL of the spore suspension was inoculated in the medium after sterilization,and then the tube was placed in thermostatic shaker to culture for 4 d at 20℃and 150 r/min.

Mucor；intracellular metabolites；High performance liquid chromatography(HPLC)；Traditional Chinese Medicine(TCM)；chromatographic fingerprint similarity evaluation system

S688.4

A

1673-1891（2015）04-0025-04

2015-09-08

史碧波（1977-），男，湖北天門人，副教授，碩士，研究方向：特色資源研究與開發。