原花青素對大鼠脊髓損傷后神經膠質酸性蛋白和腦源性神經營養因子表達的影響

陳春梅

原花青素對大鼠脊髓損傷后神經膠質酸性蛋白和腦源性神經營養因子表達的影響

陳春梅

目的 觀察原花青素對脊髓損傷后大鼠膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、腦源性神經營養因子(BDNF)表達變化的影響。方法 48只健康成年Sprague-Daw ley大鼠分為原花青素組(A組)和對照組(B組)。采用Allen法復制大鼠T9急性脊髓損傷模型，于術后1 d、3 d和7 d對各組大鼠行后肢運動功能BBB評分和斜板試驗；測定血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)；以及免疫組織化學染色檢測脊髓GFAP和BDNP的表達。結果 術后3 d、7 d，A組大鼠BBB評分和斜板試驗成績均優于B組(P＜0.05)。術后1 d、3 d及7 d，A組大鼠血清SOD活性和MDA含量優于B組(P＜0.05)。術后各時間點，A組GFAP表達均明顯低于B組(P＜0.01)；A 組BDNF表達均顯著高于B組(P＜0.001)。結論 原花青素可有效抑制脂質過氧化反應，抑制脊髓損傷后大鼠脊髓組織GFAP的表達，促進內源性BDNF的合成，從而促進脊髓損傷大鼠功能恢復。

脊髓損傷；原花青素；神經膠質酸性蛋白；神經生長因子；大鼠

[本文著錄格式] 陳春梅.原花青素對大鼠脊髓損傷后神經膠質酸性蛋白和腦源性神經營養因子表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(8):883-888.

CITED AS:Chen CM.Effectof proanthocyanidin on expression of glial fibrillary acidic protein and brain-derived neurotrophic factor in ratsafter spinal cord injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(8):883-888.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種主要由異常外力(交通事故、運動、塌方、高空墜落摔傷、高空墜物砸傷以及地震等自然災害引起的外力)作用脊柱而導致的創傷性疾病，其發病率高，往往造成不同程度的四肢癱或截癱。

脊髓損傷可以分為原發性損傷和繼發性損傷兩類。原發性損傷是指損傷即刻的機械性暴力引起的椎管連續性破壞，骨折或脫位壓迫脊髓等形式的損傷，這種損傷往往是不可逆轉的；繼發性損傷是在原發性損傷的基礎上，由于繼發性水腫，炎癥反應，局部缺血，細胞因子、生長因子及過氧化基團異常變化等對脊髓產生的毒害作用，這種繼發性損害可能更嚴重并可造成永久性功能障礙[1]。

目前臨床上對脊髓損傷的治療除及時、有效地穩定脊柱，解除脊髓壓迫，脊髓減壓等治療外，也不能忽視早期及時地應用有效的藥物治療以減少繼發性損傷，促進損傷脊髓的功能恢復[2-3]。

花青素是一種來源廣泛的存在于植物中的水溶性色素。花青素除了作為植物色素外，同時也是一類具有藥理功能的活性成分，具有很強的抗氧化功能，可以清除體內的自由基、降低氧化酶的活性，抑制炎癥等[4-5]。同西藥相比，花青素具有天然、低毒、安全的優勢，是一種理想的藥物選擇。

目前，國內外對花青素在脊髓損傷方面的研究較少。本實驗以膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為觀察指標，制備脊髓損傷模型，探討經原花青素對大鼠脊髓損傷后GFAP、BDNF表達的影響，進而探究原花青素對脊髓損傷后早期中樞神經功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康成年Sprague-Daw ley大鼠48只，雌雄不拘，體質量(240±20)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。按照隨機數字表隨機分為原花青素組(A 組)和對照組(B組)，每組24只。每組再分為1 d、3 d、7 d 3個亞組，每個亞組8只。

1.2 模型制備

大鼠術前常規行行為學測試，確認其運動功能正常后，用1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠俯臥固定于手術臺上，背部去毛，碘伏常規消毒。沿正中線切開大鼠背部皮膚，顯露椎板及棘突。明確T9位置后，沿緊靠棘突的兩邊切開背部肌肉，去除椎板，暴露脊髓，用自制數字式脊髓損傷動物模型制備儀打擊制備脊髓損傷模型(A llen法)，打擊強度為10 g×25mm。打擊后即刻見大鼠雙后肢發生不同程度抽搐，尾部甩動，隨后完全松弛，標志模型制備成功。逐層縫合切口。立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9 m l/kg補液。術后每天腹腔注射8×104U青霉素鈉3 d以防感染。待動物清醒后放回飼養籠中單籠飼養。術后大鼠自由進食、飲水，定時清潔籠具，保持適宜室溫；每天擠壓膀胱排尿3次，直至大鼠能自主排尿。

1.3 治療方法

A組：造模成功后30m in，腹腔注射原花青素40 mg/kg，此后每天注射1次；B組：造模成功后腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 運動功能評定

于造模后1 d、3 d、7 d，各組選取8只大鼠，進行以下測試。

1.4.1 BBB評分[6]

大鼠置于寬大活動場地，采用雙人盲法觀察其后肢運動情況，聯合考察大鼠后肢的運動，軀干的位置及穩定性、步態、協調性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置。取左右兩側評分的平均值作為最后評分。

1.4.2 斜板試驗[7]

大鼠置自制斜板上，墊一個橡膠墊，將大鼠身體縱軸與斜板縱軸平行，大鼠頭朝斜板抬高側，斜板傾斜角度從0°開始緩慢上升。記錄大鼠停留在斜板上維持至少5 s時的最大角度，每次測試3遍，取平均值。采用雙人盲法。

1.5 血清中丙二醛和超氧化物歧化酶

測定行為學測試完成后，大鼠經右心室取血3 m l，3000 r/m in離心15m in，取上清液，-20℃冰箱保存。用丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒測定，按試劑盒說明操作。

1.6 組織取材與切片制備

每組各取8只大鼠，于運動功能評測后，1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。打開胸腔，充分暴露心臟和主動脈根部。從左心室插管到主動脈根部，剪開右心耳，經左心室快速灌注肝素生理鹽水約200 m l，至肝臟及鞏膜蒼白。4%多聚甲醛150～200m l灌注40m in。以損傷處為中心切取脊髓組織約1 cm，4%多聚甲醛固定24 h。常規脫水、透明、浸蠟、包埋，連續橫切，厚5μm，用于免疫組織化學染色。

1.7 免疫組織化學染色

非生物素二步法進行GFAP和BDNF免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，行高壓熱抗原修復，用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。分別滴加GFAP抗體(效價1∶500)或BDNF抗體(效價1∶20)，4℃冰箱過夜。次日用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 m in，在切片上加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應，顯色充分，及時用0.01 mol/L PBS漂洗；蘇木素復染，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每張切片在顯微鏡400倍下隨機拍攝5個無重復的視野，采用Image-ProPlus6.0病理圖像分析軟件測定每個視野中累積光密度和其分布面積，計算平均積分光密度值(IOD)。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 運動功能評定

術前各組大鼠BBB評分運動功能正常，評分均為21分。術后1 d，兩組評分無顯著性差異(P＞0.05)。術后3 d、7 d，A組評分高于B組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠BBB評分比較

術后1 d，A組與B組斜板試驗角度無顯著性差異(P＞0.05)。術后3 d、7 d，A組角度大于B組(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠斜板試驗比較(°)

2.2 SOD與MDA

術后1 d、3 d、7d，A組SOD活性高于B組(P＜0.05)；A組MDA含量低于B組(P＜0.05)。見表3、表4。

表3 兩組血清SOD活性比較(U/m l)

表4 兩組血清MDA含量比較(nmol/m l)

2.3 免疫組化結果

2.3.1 GFAP

GFAP主要標記星形膠質細胞。免疫組織化學GFAP染色發現損傷處星形膠質細胞呈局灶性增生，胞質豐富且染色加深，體積增大，細胞形態不一，突起增多，隨著損傷后時間延長，細胞數目增多。脊髓損傷區GFAP的表達在A組比較少，分布比較均勻；在B組大部分為空洞，空洞周圍有強的GFAP表達，分布相對不均勻。脊髓損傷1 d后星形膠質細胞內的GFAP表達明顯增高，1～7 d內呈現進行性增高趨勢。A組脊髓損傷后1 d、3 d、7 d內損傷處GFAP表達明顯少于B組(P＜0.01)，尤其是7 d A組減少最明顯。見表5、圖1。

表5 兩組大鼠脊髓組織GFAP比較(IOD)

2.3.2 BDNF

術后1 d、3 d、7 d，兩組胞漿呈黃色染色，但染色強度不一。術后1 d兩組脊髓組織中有BDNF的微弱表達，1～7 d內呈現進行性增高趨勢。A組在術后1 d、3 d、7 d BDNF表達顯著高于B組(P＜0.001)。見表6、圖2。

表6 兩組大鼠脊髓組織BDNF比較(IOD)

圖1 兩組大鼠脊髓組織GFAP的表達(免疫組織化學染色，400×)

圖2 兩組大鼠脊髓組織BDNF的表達(免疫組織化學染色，400×)

3 討論

脊髓損傷是一種嚴重的致殘性疾病，常引起多種并發癥，嚴重影響患者的身心健康和生存質量，甚至危及生命。脊髓損傷后運動功能的缺失及恢復程度不僅與脊髓組織遭受機械性外力所致的原發損傷有關，還與原發性損傷引起的一系列病理生理反應所致的繼發性損傷有關。后者常是進行性、自毀性的破壞過程，對組織的破壞程度遠遠超過原發性損傷。故臨床治療的關鍵是盡量預防和治療繼發性損傷，從而降低病死率和神經功能的喪失，促進功能恢復。

原花青素是一類在植物界中廣泛存在的多酚化合物，它主要存在于植物的果實、種子、花和皮中，具有極強的抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧陰離子自由基和羥基自由基，也參與磷酸、花生四烯酸的代謝和蛋白質磷酸化，保護脂質不發生過氧化損傷[8-10]。國內研究發現，原花青素能有效抑制脊髓損傷后脂質過氧化和清除體內過多的自由基[11]，抑制NF-кB、IL-6、TNF-α的表達[12-13]，有效控制脊髓損傷后的炎癥反應，進而促進大鼠運動功能的恢復。國外有文獻報道，花青素可以增強神經系統的穩定性，減少缺血-再灌注所造成的腦損傷[14]，對局灶性腦缺血大鼠大腦皮質抑凋亡基因蛋白Bcl-2和促凋亡基因蛋白Bax的表達有十分重要的影響[15]。

本研究發現，脊髓損傷術后1～7 d A組和B組的運動功能均表現出一致的增長趨勢。與B組相比，術后3 d、7 d，A組大鼠BBB評分和斜板試驗成績均優于B組(P＜0.05)；術后1 d、3 d及7 d，A組大鼠血清SOD活性和MDA含量優于B組(P＜0.05)。說明原花青素可有效抑制脊髓損傷后脂質過氧化反應，清除自由基，促進神經運動功能的恢復。

GFAP是星型膠質細胞的一種標志蛋白，為其主要細胞骨架成分，相對分子質量為50～52 kDa，存在于正常星形膠質細胞和反應性星形膠質細胞中，它在神經元內環境的維持和血腦屏障中起重要作用，其表達的高低可反映星形膠質細胞的功能狀態，如星型膠質細胞增殖和肥大的程度[16]。當神經系統受到損傷時，星形膠質細胞發生反應性增生，出現GFAP表達上調。

脊髓損傷后膠質細胞反應性增生具有雙重作用[17-18]。損傷早期，膠質細胞分泌的層粘蛋白、神經生長因子(nerve grow th factor,NGF)和BDNF等可以誘導神經纖維的生長，有利于神經元的再生[19]；但是在損傷后期，由于層粘蛋白聚集成基板，釋放一系列的細胞因子作用于星形膠質細胞使其多度增生形成膠質瘢痕[20]，阻礙軸突的再生，也阻礙神經元的修復，成為脊髓功能恢復的關鍵問題之一[21]。所以抑制星形膠質細胞過度反應性增生，從而抑制膠質瘢痕的形成，將為神經元軸突再生和功能的修復提供較好的微環境。

本實驗結果也提示，脊髓損傷后1～7 d內GFAP表達呈進行性增高趨勢，且各時間點A組與B組有顯著性差異(P＜0.05)，提示原花青素能抑制GFAP的表達，抑制星形膠質細胞過度反應性增生，從而可能創造有利于神經再生的微環境，減少膠質瘢痕的形成。

BDNF是神經營養因子家族中的一個重要因子，在中樞和周圍神經系統中均具有廣泛作用[22]，它參與中樞神經系統發育過程中神經細胞的生存、分化與生長，同時還能夠維持神經細胞的正常生理功能。在成年大鼠脊髓腹角運動神經元中亦含有BDNF，產物表達主要定位于胞漿中，細胞核不著色。有研究發現，BDNF可減輕損傷脊髓的炎癥，保護損傷的神經細胞，減少細胞的凋亡數量，促進軸突大量再生[23-24]。BDNF除具有誘導神經突起定向生長、決定感覺和交感神經纖維生長方向等神經營養因子所具有的效應外，還具有運動神經營養活性，能保護脊髓運動神經元在脊髓損傷后免于死亡[25]。本實驗發現，BDNF表達在脊髓損傷后1～7 d逐漸持續增加，各時間點兩組均有顯著性差異(P＜0.05)，表明在急性脊髓損傷后早期，原花青素的應用可以促進BDNF表達，減輕神經細胞病理變化，發揮神經保護作用。

綜上所述，原花青素在脊髓損傷修復中既能在脊髓損傷后抑制GFAP的表達，又能明顯促進損傷區BDNF的表達，從而減少受傷脊髓中神經膠質細胞的增生和膠質瘢痕的形成，促進軸突再生，促進脊髓損傷后運動功能的恢復。本實驗為原花青素在脊髓損傷修復中的臨床應用提供理論依據。

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Effect of Proanthocyanidin on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein and Brain-derived Neurotrophic Factor in Ratsafter SpinalCord Injury

CHENChun-mei
Chongqing Three GorgesMedicalCollege,Chongqing 404120,China

Objective To observe the effect of proanthocyanidin on the expression of brain-derived neurotrophic factor(GFAP)and brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in ratswith spinal cord injury(SCI).Methods 48 healthy adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into proanthocyanidin treatmentgroup(group A,n=24)and controlgroup(group B,n=24).A llen'smethod was used to establish themodel of acute spinal cord injury in T9.1,3 and 7 days after operation,8 rats in each subgroup were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scale and Slanting Board Test,the serum malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)were detected, and the expression of GFAPand BDNF of the spinal cord were detected with immunohistochem istry.Results The results of BBB scale and Slanting Board Testwere better in group A than in group B 3 and 7 days after SCI(P＜0.05).The levels of SOD and MDA were better in group A than in group B 1,3 and 7 days after SCI(P＜0.05).The expression of GFAPwas lower,and the expression of BDNFwas higher in group A than in group B all the time points after SCI(P＜0.01).Conclusion Proanthocyanidin can inhibit the lipid peroxidation and the expression of GFAPin spinal cord after SCI,stimulate the synthesisof endogenous BDNF,and improve themotor function in ratsafter SCI.

spinalcord injury;proanthocyanidin;glial fibrillary acidic protein;nerve grow th factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.003

R651.2

A

1006-9771(2015)08-0883-06

2015-06-03

2015-07-07)

重慶三峽醫藥高等專科學校，重慶市404120。作者簡介：陳春梅(1976-)，女，漢族，四川岳池縣人，講師，主要從事中醫治療方面研究。