神經酰胺通過JNK/c-Jun信號通路誘導膠質瘤細胞自噬性死亡

張露勇，張淼，劉師卜，李銳

神經酰胺通過JNK/c-Jun信號通路誘導膠質瘤細胞自噬性死亡

張露勇1，張淼2，劉師卜1，李銳3

目的 探討神經酰胺對膠質瘤細胞87-MG和U251自噬性死亡的作用及機制。方法 采用MTT和流式細胞的方法檢測不同濃度神經酰胺刺激87-MG和U251細胞后細胞存活和凋亡的改變；電鏡和Western blotting技術檢測自噬和JNK/c-Jun信號通路的改變，JNK藥理性抑制劑SP600125特異性抑制JNK通路，觀察其對神經酰胺誘導自噬死亡的影響。結果 神經酰胺刺激24 h后，87-MG和U251存活呈現時間依賴性下降(P＜0.05)；相應的細胞死亡數目劑量依賴性升高(P＜0.05)，但凋亡性死亡比例較低；神經酰胺刺激后鏡下觀察到的自噬小體計數，LC3B/LC3A和Beclin-1的表達以及JNK/c-Jun的磷酸化程度都增加(P＜0.05)。提前給予SP600125抑制JNK信號通路的活性后，可以阻斷神經酰胺誘導的細胞自噬性死亡(P＜0.05)。結論 神經酰胺可誘導膠質瘤細胞87-MG和U251出現自噬性死亡，機制可能與JNK信號通路的活化有關。

膠質瘤；神經酰胺；自噬性死亡；JNK信號通路

[本文著錄格式] 張露勇，張淼，劉師卜，等.神經酰胺通過JNK/c-Jun信號通路誘導膠質瘤細胞自噬性死亡[J].中國康復理論與實踐,2015,21(8):905-912.

CITED AS:Zhang LY,Zhang M,Liu SB,et al.Autophagic cell death in glioma cell induced by ceramide through JNK/c-Jun pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(8):905-912.

神經酰胺(ceram ide,Cer)是生物膜上 “脂筏”的結構基礎，屬于神經鞘脂類。此外，Cer作為第二信使發揮重要的生物學功能[1-2]。在腫瘤領域，Cer被認為是有效的預防劑/治療劑，得到國內外專家學者的廣泛關注。一些腫瘤的治療藥物和射線等都可以通過調節Cer的合成，最終促進腫瘤細胞的凋亡，發揮良好的抗腫瘤功能[3]。過去的研究提示，Cer可以活化多種信號通路，比如激酶抑制因子(kinase suppressor of Ras, KSR)/Raf、蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)和c-Jun的氨基末端蛋白激酶(C-Jun N-term inal kinase,JNK)等，最終誘導細胞的死亡[4]。另一項研究發現，Cer也可通過降低特定部位的黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表達的水平，抑制腫瘤細胞的侵襲[5]。Cer既是JNK的激活劑，又參與細胞自噬的誘導[6]，然而JNK在Cer誘導腫瘤細胞的自噬性死亡中的關系尚未明確[7-8]。

1 材料和方法

1.1 材料

87-MG和U251細胞：中國科學院上海細胞所細胞庫。Cer和MTT試劑盒：美國SIGMA公司。DMEM培養基：美國GIBICO公司。Annexin V/PI流式試劑盒：美國BD PHARM INGINE公司。抗JNK、phospho-JNK、c-Jun和phospho-c-Jun抗體：美國CELL SINGNALING公司。抗LC3抗體和工具藥(SP600125和3-MA)：美國SIGMA公司。辣根酶過氧化物標記的山羊抗兔IgG二抗：美國SANTACRUZ公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理

87-MG和U251細胞常規培養于含有體積分數為10%胎牛血清、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、100μg/m l青霉素、100μg/m l鏈霉素和3%谷氨酞胺的DMEM完全培養基中，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，1～2 d換1次液。細胞長滿約90%后用胰酶進行消化，1∶4傳代。3-MA和SP600125的終濃度分別為10mmol/L和10μmol/L，預處理細胞1 h后加入Cer(64mmol/L的DMSO儲液，4℃保存)。

1.2.2 MTT法測定細胞活力

87-MG和U251細胞分別以3×103/孔的密度接種于96孔板，分別加入4μmol/L、8μmol/L、16μmol/ L、32μmol/L、64μmol/L的Cer，作用24 h后加入5 g/LMTT溶液，37℃培養4 h，棄去培養液。最后加入DMSO 0.2m l。待結晶溶解后，在570 nm波長處酶標儀測定吸光度值(A)和半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)。

1.2.3 流式測定細胞凋亡

30μmol/L Cer刺激87-MG和U251，分別作用0 h、6 h、12 h、24 h后用胰酶消化。消化物1500 r/m in離心15min，加入AnnexinⅤ4μl和PI5μl，常溫避光孵育15 min。上流式細胞儀測定(Becton Dickinson)，軟件分析(cellquest)。

1.2.4 Western blotting

30μmol/LCer分別刺激87-MG和U251細胞6 h、12 h、24 h，棄培養基，PBS清洗2次，加細胞裂解液后冰上孵育15m in，收集細胞，4℃、12000 r/m in離心15m in，留取上清。用BCA蛋白定量后，加入4× SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃水浴10m in，對蛋白進行變性處理，-20℃保存備用。取總蛋白25μg的各組樣品，SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜后封閉，1∶1000加一抗(anti-LC3；anti-Beclin-1；anti-JNK；anti-p-JNK；anti-c-JUN；anti-p-c-JUN；anti-GAPH)4℃孵育，次日1∶5000加入二抗，室溫搖床2 h。最后ECL顯色，暗室曝光。

1.2.5 電鏡觀察自噬小體

30μmol/L Cer處理87-MG和U251細胞24 h后，PBS洗3次，加入2.5%戊二醛溶液固定2.5～3 h。棄戊二醛，0.1mol/L的PBS洗3次。隨后用1%餓酸后固定2 h。乙醇逐級脫水后用乙酸異戊酯替換細胞內酒精，臨界點干燥后送電鏡室。HITACHIH-7650型透射電鏡觀察自噬體、溶酶體的形態及數量，并攝片。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞存活率

不同濃度Cer作用24 h后87-MG(F=8.09,P＜0.05) 和U251(F=9.07,P＜0.05)細胞抑制率具有劑量依賴性；IC50分別為5.57μmol/L和15.27μmol/L，95%可信區間分別為(1.9×10-5,2.4×10-5)和(1.8×10-5,2.3×10-5)。見圖1。

可見Cer對兩種惡性膠質瘤細胞均有較強的抑制作用，且87-MG細胞的敏感性高于U251細胞。32 μmol/L Cer即可產生明顯抑制細胞存活的作用(P＜0.01)，因此后續實驗我們采用近似濃度(30μmol/L)進行檢測，與本室前期機制相關實驗保持一致。

2.2 細胞凋亡

隨著Cer濃度的增加，兩種細胞PI陽性率(壞死細胞)逐漸增加，作用1 h后即表現出顯著性差異(F= 7.01,F=6.72,P＜0.05)。

Cer作用后，兩種細胞的Annexin V陽性率(早期凋亡)均較低，且Cer作用后不同時間點，細胞早期凋亡無顯著性差異(P＞0.05)。見圖2。

2.3 細胞自噬水平

給藥0 h、6 h、12 h、24 h后，LC3B/LC3A水平表達水平逐漸上調。作用12 h后，兩種細胞的LC3B/ LC3A表達水平均明顯高于0 h(F=8.59,F=7.31,P＜0.01)；87-MG中Beclin-1表達水平明顯高于0 h(F= 9.85,P＜0.01)。作用24 h后，U251中Beclin-1表達水平明顯增加(F=7.59,P＜0.01)。見圖3A、3C。

給予3-MA后，LC3B/LC3A(P＜0.05)和Beclin-1的表達水平降低(P＜0.01)，見圖3B、3D。腫瘤細胞死亡減少(F=5.09,P＜0.01)，見圖4A、4B。電鏡下可以觀察到Cer誘導自噬小體數目的增加。見圖4C、4D。

圖1 不同濃度Cer對87-MG and U251細胞增殖的影響

2.4 Cer激活JNK/c-Jun信號通路促進自噬的發生

87-MG和U251細胞中JNK的磷酸化水平升高(F= 8.59,F=9.29,P＜0.01)，并隨作用時間的延長激活作用越明顯。JNK下游重要的轉錄因子c-Jun的磷酸化水平也明顯上調(F=8.14,F=9.01,P＜0.01)，并具有時間依賴性。見圖5A、5B。

應用JNK高選擇性抑制劑SP600125預處理87-MG和U251細胞1 h后，聯用SP600125與單用Cer相比，可以抑制JNK激酶的磷酸化(F=7.59,F=8.29, P＜0.05)，并減少LC3A向LC3B的轉化(F=7.36,F= 7.39,P＜0.05)。見圖6A、6B。

3 討論

細胞死亡主要有程序性死亡和非程序性死亡兩大類。近年來，自噬性死亡作為一種新的程序性死亡方式，成為生物學研究領域的熱點。

自噬又被稱為第二類程序性死亡，該過程首先是細胞形成雙層膜結構包裹待降解物質形成自噬小體，后者與溶酶體結合形成自噬溶酶體，最終待降解物質在酶的作用下被降解清除。

自噬在腫瘤疾病的發生發展過程中發揮極為重要的作用。眾多研究發現，多種治療方法都可以激活腫瘤細胞的自噬過程，自噬被認為是抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞死亡的機制之一[9]。中樞神經系統的膠質瘤具有高發病率、高惡性的特點，至今公認的治療手段是手術與放、化療綜合處理。但惡性較高的膠質瘤在術后易復發和轉移，病患平均的生存時間只有13個月[10]。保守的藥物治療又很容易引起耐藥性的出現。

綜上所述，尋找新的藥物靶點，對惡性膠質瘤的治療十分關鍵。越來越多數據顯示，自噬在藥物抗腫瘤的過程中發揮關鍵作用，比如替莫唑胺[11]、姜黃素[12]、原人參萜二醇[13]等的抗腫瘤作用均與自噬的誘導有關。近年來有關Cer促進腫瘤細胞死亡的機制研究得到越來越多重視[14]，但其誘導細胞死亡的作用是否與自噬相關還不清楚。

我們前期的實驗證明Cer可以活化下游的JNK信號，介導大鼠腦膠質瘤C6細胞的自噬性死亡。然而該細胞株不能代表所有的膠質瘤，有一定的局限性。為了進一步驗證Cer誘導腫瘤細胞自噬性死亡的普遍性，我們進一步在不同遺傳背景和不同敏感性的膠質瘤細胞中進行研究。

本實驗發現Cer可劑量依賴性地降低87-MG和U251細胞的存活率，增加細胞的死亡率，與前期C6細胞系的結果相一致。但Annexin V-FITC/PI雙染的數據提示，凋亡細胞只占死亡細胞的極少部分，因此推測Cer誘導的細胞死亡可能是凋亡之外的其他方式。

為了更好地研究自噬，自噬的檢測方法尤為重要。自噬相關蛋白的檢測是常用方法之一。如自噬相關蛋白LCA3向LC3B的轉化，參與自噬小體的形成，LC3B/LC3As比值反映了細胞的自噬水平的高低[15]。Beclin-1也是自噬調節的一個重要基因，可以通過與Vps34/PI3K形成復合物參與自噬小體的形成[16-17]，Beclin-1的雜合性缺失被認為是腫瘤惡性轉化的原因之一[18]。

圖2 Cer對87-MG和U251細胞凋亡的影響

圖3 Western blotting檢測Cer對自噬相關蛋白LC3和Beclin-1水平的調控

圖4 Cer通過促進自噬誘導87-MG和U251細胞的死亡

圖5 Western bloting 檢測Cer對JNK信號通路的影響

圖6 JNK抑制劑SP600125逆轉Cer誘導的87-MG and U251細胞自噬水平的增加

本研究發現，Cer作用時間的延長可以誘導87-MG和U251細胞LC3B和Beclin-1表達水平的升高，并具有時間依賴性，提示Cer可以誘導87-MG和U251通過自噬途徑死亡，與流式細胞檢測結果一致。在細胞應對外界刺激的過程中，Cer能夠激活信號通路包括JNK并誘導細胞死亡[19]。實驗數據提示，放射線和化療藥物作用于腫瘤后可以產生Cer，后者作為第二信使，可以活化下游JNK信號通路[5]。最新的數據還顯示，JNK信號通路和細胞自噬也密切相關[20]。應用半胱氨酸酶(caspase)的藥理性抑制劑zVAD抑制caspase-8，或者小干擾RNA沉默caspase-8，都可以激活纖維母細胞中JNK信號通路介導的自噬性死亡[8]。還有研究認為，JNK可以磷酸化Bcl-2的多個磷酸化位點，降解Bcl-2-Beclin1的復合物，游離Beclin-1，進而誘導自噬[21]。如上所述，JNK信號與自噬的關系十分密切，且是Cer下游的重要信號通路之一。在本項研究中，我們發現JNK信號的活化在Cer誘導膠質瘤細胞自噬的環節中發揮十分關鍵的作用。Cer能明顯上調87-MG和U251細胞中JNK及其下游轉錄因子c-Jun的磷酸化程度。當借助JNK特異性抑制劑SP600125抑制JNK的活性后，Cer誘導的自噬激活被逆轉。

綜上所述，JNK可能是Cer誘導膠質瘤細胞自噬死亡的機制之一。Cer通過上調JNK信號通路，介導膠質瘤細胞發生自噬性死亡，為抗腫瘤藥物的開發提供了新的思路。

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Autophagic CellDeath in G lioma Cell Induced by Ceram ide through JNK/c-Jun Pathway

ZHANG Lu-yong1,ZHANGMiao2,LIU Shi-bu1,LIRui3
1.Institute for Food and Cosmetics Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100044,China; 2.Departmentof PharmaceuticalCare,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China;3.Departmentof Neurosurgery,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

Objective To observe the autophagy of 87-MG and U251 glioma cells induced by ceramide and explore the possiblemechanism.Methods The viability and apoptosisof 87-MG and U251 cellswere detected by MTT assay and flow cytometry,respectively.Autophagic-related protein expressions of LC3B/LC3A and Beclin-1 were determined byWestern blotting.The activation of JNK/c-Jun signaling pathway induced by ceram idewith orwithout the treatmentof JNK specific inhibitor SP600125 was alsomeasured.Results 24 hours after treatmentof ceram ide,the grow th of 87-MG and U251 cellswas significantly inhibited time-dependently(P＜0.05);and the number of autophagic cells increased dose-dependently(P＜0.05).The levels of LC3B/LC3A and Beclin-1 significantly increased after ceram ide treatment(P＜0.05).JNK signaling pathway wasactivated in the87-MG and U251 cellsand the phosphorylation of c-Jun also increased after ceramide treatment.This activation of autophagy could be reversed by the pre-treatmentof SP600125.Conclusion Ceramidemay induce autophagy in 87-MG and U251 glioma cellsand themechanism may be related to the activation of JNK/c-Jun signaling pathway.

glioma cell;ceram ide;autophagic celldeath;JNK signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.007

R730.264

A

1006-9771(2015)08-0905-08

2015-04-08

2015-06-12)

1.中國食品藥品檢定研究院食品化妝品所，北京市100044；2.中國人民解放軍總醫院外科藥房，北京市100853；3.中日友好醫院神經外科，北京市100029。作者簡介：張露勇(1980-)，男，漢族，山東榮成市人，碩士，助理研究員，主要從事食品、保健食品、化妝品的功能毒理評價研究工作。通訊作者：李銳(1971-)，男，漢族，云南昆明市人，主治醫師，主要從事神經相關疾病的研究。E-mail:reedleer@sina.com。