高效液相色譜—蒸發光散射法檢測雪膽溶液中雪膽甲素的研究

駱延波　劉曉東　胡明　李璐璐　齊靜　劉玉慶

摘要：采用HPLC-ELS法，C18柱（4.6mm×250mm），流動相為乙腈-水（40：60）；流速0.8mL/min；柱溫為室溫；檢測器為Alltech 2000蒸發光散射檢測器；檢測溫度100℃；ELSD載氣為高純氮氣；載氣壓力為0.35MPa，對雪膽溶液中雪膽甲素含量進行測定。結果表明：在該方法下，雪膽甲素進樣量在3.34～16.70μg之間，進樣量的自然對數與峰面積積分值的自然對數呈良好的線性關系，其平均回收率為98.81%，RSD為0.92%（n=6）。所建方法簡便易行、準確可靠，可用于雪膽溶液中雪膽甲素含量的測定。

關鍵詞：雪膽溶液；雪膽甲素；高效液相色譜-蒸發光散射法；含量測定

中圖分類號：S853.73

文獻標識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0102-04

雪膽溶液是經提取雪膽制成的單味藥制劑，其主要有效成分為雪膽甲素。雪膽提取物的檢測很多采用高效液相一紫外光檢測法，均為末端吸收法。在用高效液相一紫外檢測法測定時，由于雪膽甲素只在紫外末端有吸收，若采用低波長（200～210nm）檢測，則溶劑背景難以消除，難以得到理想的測定結果。而示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器均能夠避免紫外檢測時末端吸收的缺陷。示差折光檢測器是基于樣品組分的折射率與流動相溶劑折射率有差異的原理。蒸發光散射檢測器是基于把從色譜柱分離的組分霧化為小顆粒，在其穿過光束時導致光散射而被檢測的原理。但是考慮到示差折光檢測器對環境要求極為苛刻，而且靈敏度低，而利用蒸發光散射檢測器可以利用黃芪甲苷分子量大、熔點較高的優點，有效避免因為末端吸收而帶來的雜質峰干擾，是測定黃芪甲苷較理想的方法。為進一步提高檢測的精確度，對雪膽甲素的含量采用HPLC法，用蒸發光散射檢測器進行檢測。

1材料與方法

1.1材料

雪膽：購自河北安國中藥批發市場；雪膽甲素對照品：購自中國藥品生物制品檢定所，批號111518-200602；雪膽溶液：由山東德州神牛藥業有限公司提供，樣品批號為20120501、20120502、20120503。

1.2儀器與試藥

島津LC-10A高效液相色譜儀，ELSD-All-tech 2000蒸發光散射檢測；色譜柱：C18，4.6mm×250mm，乙腈為色譜純（迪馬）；水為純凈水（娃哈哈）。

1.3HPLC-ELS檢測法的色譜條件

參照有關文獻[7～11]，選用C18柱（4.6mm×250mm），流動相為乙腈-水（40：60）；流速0.8mL/min；柱溫為室溫；檢測器為Alltech 2000蒸發光散射檢測器；檢測溫度100℃；ELSD載氣為高純氮氣；載氣壓力為0.35MPa。

1.4試驗用溶液制備

1.4.1樣品溶液制備 方法（1）：精密量取雪膽溶液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，再精密移取5mL置25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，備用。方法（2）：精密量取雪膽溶液1mL置25mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，備用。采用上述色譜條件進行試驗，記錄峰面積，方法（1）得到的峰面積為222491，方法（2）得到的峰面積為616732，故取方法（2）制備樣品溶液。

1.4.2對照品溶液制備 精密稱取雪膽甲素對照品20.88mg置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.835mg/mL的溶液，搖勻，濾過，備用。

1.4.3空白對照溶液 甲醇溶液。

1.4.4對照藥材溶液制備 稱取1.0g雪膽藥材，加90%乙醇50mL，超聲提取30min，濾過，取濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解移至25mL量瓶中，定容，搖勻，濾過，備用。

1.5檢測方法檢驗

1.5.1專屬性試驗 取空白對照溶液、對照品溶液、對照藥材溶液、樣品溶液，按照色譜條件進行試驗，記錄色譜圖。

1.5.2線性關系考察 精密量取上述對照品溶液2、3、4、6、10mL，加甲醇稀釋至10mL，搖勻。分別精密量取上述溶液20μL注入高效液相色譜儀，測其峰面積積分值，以峰面積（A）的自然對數為縱坐標，進樣量（C）的自然對數為橫坐標，計算回歸方程。

1.5.3精密度試驗 取對照品溶液10μL，連續進樣6次，測定峰面積積分值，求其自然對數、平均值和RSD。

1.5.4穩定性試驗 取樣品溶液，在0、2、4、8、12h分別進樣，測定峰面積積分值，求其自然對數。

1.5.5重現性試驗 重復上述操作，對批號為20120501的樣品溶液各測定6份，取平均值。

1.5.6回收率試驗 取批號為20120501的樣品溶液0.5mL，共6份，分置25mL量瓶中。稱取35.2mg雪膽甲素置50mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取5mL添加至放有樣品溶液的量瓶中。按1.3的色譜條件進行測定，計算回收率。

回收率=測得量-樣品中含量/加入對照品的量×100%

1.5.7樣品測定 按1.3的色譜條件對3批樣品溶液進行測定，重復2次。

2結果與分析

2.1專屬性

由圖1可見，在樣品溶液色譜圖中，與對照品溶液和對照藥材溶液相同保留時間處，有相同的色譜峰呈現；在空白對照溶液色譜圖中，相同保留時間處無相同的色譜峰呈現，說明空白無干擾。

2.2線性關系

表1和圖2結果表明，雪膽甲素進樣量在3.34～16.70μg之間，進樣量（C）的自然對數與峰面積積分值（A）的自然對數呈良好的線性關系。

2.3精密度

表2結果顯示，ln（A）平均值為12.6889，RSD為0.023%，儀器精密度良好。endprint

2.4穩定性

表3結果顯示，樣品溶液在12h內穩定性良好。

2.5重現性

由表4可見，雪膽甲素平均含量為7.6726mg/mL，RSD=0.33%，表明該方法重現性良好。

2.6回收率

由表5可見，平均回收率為98.81%，RSD為0.92%，表明該方法回收率良好。

2.6樣品測定結果

結合藥典中含量規定及本品處方投料量，雪雪溶液每毫升含雪膽甲素（C₃₀H₄₂O₆）不得少于6.0mg。表6可見，3批樣品測定結果均大于6.0mg/mL，說明該方法可行。

3討論與結論

蒸發光散射檢測器的響應不依賴樣品的化學性質，任何揮發性低于流動相的樣品均能被檢測，且響應因子一致。本試驗使用的Alltech 2000蒸發光散射檢測器是低溫型檢測器，當漂移管的溫度為40℃時可以把沸點為100℃的水完全霧化，能夠把基線噪音控制在較低水平。本試驗結果表明，以雪膽甲素為指標成分，測定雪膽溶液中雪膽甲素含量，重現性好，無雜質峰干擾，簡便易行，準確可靠，因此可作為質量標準的控制指標。

參考文獻：

[1]王賢英，高效液相色譜法測定長果雪膽中雪膽甲素的含量[J]，重慶中草藥研究，2007（1）：11-13.

[2]何效平，楊瓊芳，王賢英，等，高效液相色譜法測定雪膽中雪膽甲素的含量[J]，川北醫學院學報，2007，22（3）：264-265.

[3]郭兆榮，李笑然，楊世林，等，高效液相色譜-蒸發光散射法測定雪膽胃腸丸中黃芪甲苷的含量[J]，中國醫院藥學雜志，2010，30（1）：88-89.

[4]蘇紅，白華，齊靜，等，中藥雪膽及其制劑研究進展[J]，中國畜牧獸醫，2012，39（3）：202-205.

[5]魏云，雪膽的鑒別及含量測定[J]，成都中醫藥大學學報，2011，34（3）：81-85.

[6]徐金中，董建勇，葉筱琴，等，中華雪膽皂苷類化學成分研究[J]，中國中藥雜志，2009，34（3）：291-293.

[7]許瓊明，郭兆榮，楊世林，等，HPLC測定雪膽胃腸丸中的延胡索乙素[J]，中國現代應用藥學，2010，27（5）：436-439.

[8]施亞琴，楊培全，臺云梅，等，反相高效液相色譜法測定不同采收期長果雪膽中雪膽甲素的含量[J]，中國中藥雜志，1996，21（5）：276-277.

[9]李勝容，王賢英，HPLC測定金洋冠心膠囊中雪膽甲素的含量[J]，中成藥，2008，30（10）：23-24.

[10]葉曉霞，丁立生，黃可新，超聲提取-分光光度法測定浙江雪膽中總皂苷含量[J]，天然產物研究與開發，2006（18）：631-633，662.

[11]郭兆榮，李笑然，楊世林，等HPLC同時測定雪膽胃腸丸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿[J]，中成藥，2009，31（2）：326-327.endprint