維生素C對DC細胞功能調控影響研究①

賈　原　李文麗　李　芳　趙　晴　張俊萍(山西醫學科學院山西大醫院腫瘤內二科(生物治療)，太原030032)

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維生素C對DC細胞功能調控影響研究①

賈原李文麗李芳趙晴張俊萍②
(山西醫學科學院山西大醫院腫瘤內二科(生物治療)，太原030032)

［摘要］目的:探討維生素C(VC)對樹突狀細胞(DC)的影響，并檢測DC細胞成熟情況，為快速制備DC疫苗提供一種可行方法及思路。方法:采集健康志愿者外周血50 ml，用淋巴細胞分離液分離外周血PBMC，貼壁后獲得單核細胞。用不同濃度VC對DC進行孵育(24 h)，后經PBS洗滌，并設立空白對照組(V0)。流式細胞儀檢測DC表面共刺激分子CD80/86及HLA-DR，CD40表達情況。通過設置VC濃度梯度及時間梯度，考察VC對DC刺激的最佳濃度及最佳成熟時間，同時分析VC促進DC成熟的原因。結果: VC可顯著刺激DC細胞成熟，其CD80/86表達較未添加VC組有明顯提升。且本研究顯示VC刺激DC的最佳濃度為1 mmol/L，當DC培養至第三天時，VC組CD80/86表達率為(78.6±4.6) %，而空白對照組V0僅為(34.1±5.7) %; DC表面HLA-DR表達: VC(56.8±4.4) %，空白對照組V0為(25.4±4.7) %，兩組差異有統計學意義，P＜0.05;進而我們考察了VC對DC細胞CD40、CD40L表達情況，結果顯示，VC 2.5 mmol/L組CD40表達率最高可達(59.3±3.7) %，V0組僅為(11.1±2.4) %，說明VC可顯著調節DC表面CD40的表達。而CD40L表達調節并未體現。熒光顯微鏡結果顯示VC-DC抗原捕獲能力顯著提升。結論: VC可顯著調控DC成熟，并可能通過上調CD40進而促進CD80/86及HLA-DR的表達，當VC濃度為1 mmol/L時，對DC調控作用最強。

［關鍵詞］維生素C;樹突狀細胞;表面共刺激分子; CD40

①本文受山西省生物治療示范平臺項目資助(No.2014091105-0101)。

Regulation impact of vitamin C in DC function

JIA Yuan，LI Wen-Li，LI Fang，ZHAO Qing，ZHANG Jun-Ping.Department of Medical Oncology(Cancer Bio-Therapy)，Shanxi Academy of Medical Sciences，Taiyuan 030032，China

［Abstract］Objective: To study the influence of vitamin C (VC) on dendritic cells (DC)，and detect DC maturation，to provide a feasible method and thought for quickly preparating DC vaccines.Methods: Collected the peripheral blood (about 50 ml) from healthy volunteers，and isolated peripheral blood mononuclear cells with lymphocyte separation medium and obtain DC.With stimulating with different concentrations of VC for (24 h)，then washed with PBS，and set up blank control group (V0) .The expression of DC surface costimulating molecules CD80/86 and HLA-DR，CD40 was detected by flow cytometry.By setting the concentration gradient and time gradient，exciting optimal concentration and stimulating time of VC on DC，and analyzed the reasons of VC promoting DC maturation.Results: VC could effectively stimulate DC，CD80/86 expression had significantly increased contrast to the blank control group(V0) .And the experiments show that VC’s best stimulating concentration was 1 mmol/L，and on the third day，the CD80/86 expression rate of VC group was (78.6±4.6) %，and blank control group V0 was (34.1±5.7) %.DC surface HLA-DR expression: VC (56.8±4.4) %，blank control group V0 (25.4±4.7) %，the difference between two groups was statistically significant，P＜0.05.CD40 and CD40L expression and results show that VC 2.5 mmol/L group of CD40 expression rate up to (59.3±3.7) %，while V0 group was only (11.1±2.4) %，that illustrate VC could significantly regulate CD40 expression on DC surface，but CD40L not reflect.Fluorescence microscope results showed that DC’s antigen catching ability was also significantly promoted.Conclusion: VC can significantly regulate DC maturity，and may up regulate CD40，thus promoting the express of CD80/86 and HLA-DR.When the concentration is 1 mmol/L，VC expresses the strongest regulation function on DC.

［Key words］Vitamin C; Dendritic cell (DC) ; Co-stimulating molecular; CD40

維生素C是人體所必需的一類小分子營養物質，它可確保機體功能正常發揮及免疫功能穩定。研究顯示［1］，高濃度的維生素C富集于多種免疫細胞中，包括:嗜中性粒細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞等，扮演“抗氧化劑”作用以對抗機體氧自由基［2］，且因感染及炎癥而快速消耗，表明VC可能是維持自發免疫及獲得性免疫穩定的一個重要因素。另外，VC還可提升淋巴細胞的增殖能力及NK細胞的自然殺傷活性［3，4］。而May等［5］另一項研究顯示，VC也可增加嗜中性粒細胞及巨噬細胞抗菌活性，但對于T淋巴細胞數量卻未見影響。Noh［6］另據報道顯示，遲發型超敏反應(DTH)發生會因VC含量缺乏而減弱，而對VC進行補充后，DTH反應又會恢復至正常水平。

另有細胞免疫研究顯示，對于Gulo(-/-)基因缺陷型小鼠(L-古洛糖酸內酯氧化酶基因缺陷型小鼠，突變可能導致部分動物無法合成Vc)［7］，VC可促進免疫反應向Th1細胞分化，進而促進IFN-γ、TNF-α的產生，當VC缺乏時可能導致小鼠炎癥的發生。而隨著VC的持續補充，Th1型免疫反應顯著提升，同時小鼠體內IgG1、IgE以及Th2型免疫細胞抗體明顯下降，而一種Th1型免疫相關抗體IgG2C含量也會顯著提高，并且會提升DTH反應強度［7，8］，表明VC會顯著影響CD4+細胞亞群分化。另據Hwang［4］報道，VC還可促進外周血CD8+記憶性T細胞增殖［4］。但VC如何對免疫進行調控，其機制目前尚不明了。

樹突狀細胞(DC)是功能最強的抗原提呈細胞(APC)。當免疫共刺激分子，如CD80、CD86等在DC細胞表面高表達時，DC細胞可快速提呈抗原信息，發揮免疫功能，刺激T淋巴細胞成熟［9，10］。同時，DC的成熟與分化還與細胞天然免疫Toll樣受體(TLR)密切相關。研究報道，作為氧化劑的H2O2可顯著刺激DC細胞成熟、分化，并上調CD4+免疫反應［11，12］。那么作為抗氧化劑的VC(抗壞血酸)對DC細胞成熟與分化是否有影響? VC如何調控DC細胞發揮免疫調控作用?其細胞表面共刺激分子如何表達?本文將就此展開研究。

1　材料與方法

1.1試劑耗材維生素C(VC)購自Sigma，rhGMCSF、rhIL-4、rhTNF-α(Peprotech公司)，10%胎牛血清(杭州四季青)，RPMI1640(Scientific公司)，FITC標記CD86mAb，PE標記CD80mAb，APC標記MHCⅡDR，FITC標記CD40mAb，PE標記CD40L(CD154) mAb，Ficoll分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)。

1.2儀器設備倒置顯微鏡(奧林巴斯)，CO2細胞培養箱(Thermo)，臺式冷凍離心機(湖南湘智)，臺式高速離心機(Eppondorf)，流式細胞儀(BD公司)，生物安全柜(新加坡ESCO)。

1.3主要方法

1.3.1細胞分離采集健康志愿者外周血與PBS按照1∶4混合均勻，將稀釋后的血液以1∶1比例緩慢加入淋巴細胞分離液上方，4℃2 000 r/min離心15 min。小心吸取單個核細胞層，加入另一離心管中，并用4倍體積PBS洗滌1 000 r/min離心5 min，離心去除淋巴細胞分離液。PBS洗滌兩次后，即獲得外周血單核細胞。

1.3.2 DC細胞培養外周血單核細胞懸浮于1640培養基中，調整濃度為108ml－1，于48孔細胞培養板上貼壁。在37℃、5%CO2培養箱中貼壁培養3～6 h后，收集懸浮細胞，貼壁細胞PBS蕩洗兩次后為DC前體細胞，于顯微鏡下觀察計數，加入1640培養基: GM-CSF(800 U/ml)和IL-4(1 000 U/ml)，細胞濃度約為106ml－1并繼續培養。

1.3.3實驗組設置于48孔板細胞培養液中加入不同濃度VC，濃度梯度為0 μmol/L、100 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L，1 mmol/L、2.5 mmol/L。貼壁的DC前體細胞洗滌后，加入上述濃度VC(RPMI1640，10%FBS，GM-CSF 800 U/ml和IL-4 1 000 U/ml)孵育24 h，洗滌，之后培養液RPMI1640，10%FBS，GM-CSF 800 U/ml和IL-4 1 000 U/ml培養。

1.3.4 CD80、CD86、CD40、CD40L (CD154)以及HLA-DR表達分析DC細胞經吹洗后懸浮，用FITCCD86mAb、PE-CD80mAb、APC-HLA-DR、FITCCD40mAb、PE-CD40L(CD154) mAb標記DC 30 min之后上流式細胞檢測儀進行檢測分析。

1.3.5熒光倒置顯微鏡觀察VC-DC抗原捕獲能力

NY-ESO-1是目前證實最具免疫原性的腫瘤-睪丸抗原(CT-Antigen)之一，其155～167位點是其發揮免疫原性的核心抗原決定簇。本項目組將NY-ESO-1155-167與熒光素FITC共價合成，與VC-DC孵育2 h后洗滌(10 ng/ml)，并在熒光顯微鏡下觀察。通過熒光灰度檢測，對比未加VC培養的DC細胞熒光強度。

1.4統計學分析應用SPSS21系統分析軟件進行分析。數據均以x ±s表示，兩樣本均數的比較采用配對的t檢驗，多樣本均數的比較采用方差分析，方差不齊用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1形態學觀察較之未添加VC實驗組，DC培養過程中加入VC可顯著提升DC的成熟速度及分化程度。細胞形態學觀察顯示，隨著培養時間的延長，DC表現為細胞懸浮生長，體積變大，樹突狀分化顯著(第三天) (如圖1A～D)，同時呈現出對VC的濃度依賴性。2.2 VC可上調DC表面CD80、CD86表達氧化還原(Redox)調節反應是細胞內一種普遍的調節方式。研究顯示，在H2O2存在情況下，可刺激DC細胞表面共刺激分子CD80、CD86表達［11］。而在本研究中，我們對比了不加VC(空白對照)及不同濃度VC下DC細胞表面二類共刺激分子標志CD80、CD86表達情況影響。結果顯示，VC可顯著促進DC表面二類分子CD80、CD86表達(圖2A、B)，并呈現濃度依賴正相關性。同時本實驗還顯示，VC對DC細胞CD80/86調節最佳濃度約為1 mmol/L，作用時間約為3 d，成熟度CD80/86可達(78.6±4.6) %(圖2C)。

2.3 VC可刺激APC細胞表面MHCⅡ分子DR表達

在機體的抗腫瘤免疫反應中，細胞免疫發揮主要的效應。CD8+的細胞毒性T細胞(CTL)是有效抗腫瘤細胞免疫的核心［4］，而這與DC息息相關。未成熟的DC能通過內吞作用高效的捕捉抗原，胞內加工處理后與MHCⅠ、MHCⅡ形成復合體，再提呈于DC表面，為激活抗原特異性的T淋巴細胞提供必需的第一信號［8-10］。因此我們考察了VC對DC細胞表面MHCⅡ類分子DR表達影響。結果顯示，VC可顯著刺激MHCⅡ分子DR表達(P＜0.05) (圖3A、B)，并呈現VC濃度依賴性及作用時間依賴性，當VC濃度達到1 mmol/L(處理24 h)，培養3 d后DC表達MHCⅡDR達到(56.8±4.4) %(圖3B、C)。

2.3 VC可上調DC表面CD40表達進而我們做了CD40及CD154表達情況，結果顯示(圖4)，DC細胞表面CD40表達隨著VC作用濃度增加而呈現梯度依賴性，而CD154并沒有顯示此特性(P＜0.05)，說明VC促進DC細胞成熟可能通過上調CD40表達進而刺激B7-1(CD80)、B7-2(CD86)及MHCⅡDR表達。

2.4 VC-DC抗原捕獲能力顯著提升將1 mmol/ L VC培養3 d的DC與未加VC培養的DC抗原捕獲能力相比較，利用FITC標記的NY-ESO-1155-167與DC細胞共孵育2 h，洗滌兩次后經熒光倒置顯微鏡觀察，發現VC-DC其熒光強度顯著高于未經VC刺激的DC(圖5A～D) (細胞濃度106ml－1)。通過熒光灰度檢測顯示，VC-DC捕獲抗原能力顯著高于未經刺激的DC(圖5E)，說明VC不僅可促進DC細胞成熟，同時也可促進DC細胞的抗原捕獲及提呈能力。

圖1　 DC細胞形態觀察(×200)Fig．1 DC cell morphological observation(×200)

圖2　 VC對DC細胞共刺激分子CD80/86調控影響Fig．2 Regulation effect of VC to stimulation molecules CD80/86 on DC

圖3　 VC對DC細胞表面HLA-DR調控影響Fig．3 Regulation effect of VC to HLA-DR on DC

圖4　 VC對DC表面CD40調控影響Fig．4 Regulation effect of VC to CD40 on DC

3　討論

Note: A.DC cells on microscope; B.DC cells on fluorescence microscope with no peptides; C.The antigen capturing ability of VC-DC to FITC-peptide; D.The antigen capturing ability of DC with none VC to FITC-peptides; E.The detection of Fluoresent gray level on DC of Fig.C and D.VC= 1 mmol/L，peptides= 10 ng/ml，2 h.

維生素C是一種有效防止氧化損傷的抗氧化劑，可清除細胞內氧化自由基(O2－)［4］。生理范圍下，維生素C在血清中含量一般在70～100 μmol/L。研究顯示，靜脈注射3 g維生素C，其受注者血清中VC的含量可達到1 700 μmol/L，但是如果患者口服相同劑量，血液中VC含量僅達220 μmol/L［6］。本實驗證明在高濃度VC(2.5 mmol/L)影響下DC細胞依然可保持生理活性，較之生理濃度要顯著高出很多，因此我們認為高劑量的VC(如文中1 mmol/ L)對于聯合放化療治療癌癥是一種途徑。

據研究顯示VC可作為一種抗腫瘤前體物質調控腫瘤細胞凋亡及抑制生長，大劑量的VC(約5 mmol/L)可引起腫瘤細胞的凋亡，當黑色素瘤細胞B16F10暴露在VC中時［13，14］，VC可引起細胞色素C釋放進而引起線粒體酶減少。又有研究顯示，VC可通過下調CD71(轉鐵蛋白)的表達進而降低細胞對金屬離子(鐵離子)的攝入，后者被認為是維持腫瘤細胞活性的必要因素之一［15］;而低劑量的VC(小于1 mmol/L)，又可通過調節Chk2-p53-p21Waf1/ Cip1途徑以及影響細胞膜上受體生長因子，如胰島素樣生長因子(IGF) -1等來抑制腫瘤細胞增殖［16］。且對于VC的抗腫瘤機制又有了新的發現，VC可以通過抑制血管內皮生長因子(VEGF)的表達而抑制腫瘤血管生成［16］。而另據Chen等［17］研究認為VC抗腫瘤機制可能是VC會釋放游離過氧化氫，直接作用于腫瘤細胞DNA干擾腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡。但VC作為免疫調控物質的研究卻鮮有報道。

CD80、CD86是DC細胞表面共刺激分子，作為重要的第二信使可刺激T淋巴細胞發揮功能，因此CD80、CD86的上調意味著DC功能的成熟［12］。研究顯示CD80、CD86受CD40-CD40L調控，并成正相關［9］。本文證明VC可有效調控DC細胞成熟，當濃度為1 mmol/L時，對DC表面共刺激分子CD80、CD86，MHCⅡDR及CD40表達有顯著上調作用，很可能VC通過上調CD40的表達進而刺激CD80、CD86及MHCⅡ表達，以增強DC抗原捕捉、提呈等功能。同時本研究證明VC處理最佳濃度為1 mmol/L時，DC最佳培養時間為3 d，較之傳統DC培養方法7 d顯著縮短時間，可用于快速制備DC疫苗。

而另一方面，H2O2等氧化劑可顯著上調DC細胞的分化程度，那么作為抗氧化劑的VC為何也能上調DC分化及活性?就VC而言，存在兩種形式，還原態(抗壞血酸)及氧化態(脫氫抗壞血酸，DHA)，并且能在二者之間快速循環，這個過程中可能產生大量的游離O2－自由基，進而上調DC活性。但對于VC調控DC細胞的分子機制以及VC的免疫反應，特別是對T淋巴細胞的調控機制還需進一步詳細的研究。

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［收稿2015-04-20修回2015-06-24］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．006

作者簡介:賈原(1983年－)，男，技師，主要從事腫瘤免疫治療方面研究，E-mail: john83629@ sina．com。

通訊作者②，E-mail: junpingzhang_118@163．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1324-05

文獻標志碼A

中圖分類號R392-3