安石榴甙對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用

李曉娟　賀順堯(河南省南陽胸科醫院檢驗科，南陽473000)

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安石榴甙對LPS誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用

李曉娟賀順堯①(河南省南陽胸科醫院檢驗科，南陽473000)

［摘要］目的:探討安石榴甙在LPS誘導的急性肺損傷中的保護作用。方法:腹腔注射20 mg/kg體重的LPS(脂多糖)制備ALI(急性肺損傷)小鼠模型，誘導小鼠急性肺損傷。隨機將60只小鼠分為6組，每組10只:正常對照組，LPS組，LPS+安石榴甙組(10、20、40 mg/kg體重)，LPS+地塞米松組。安石榴甙和地塞米松均在注射LPS前2 h腹腔注射給藥，然后小鼠再腹腔注射致死量的LPS，正常對照組小鼠只給予腹腔注射等體積的PBS。HE染色，觀察小鼠肺組織在不同處理條件下的病理變化和肺損傷程度;稱量小鼠濕肺、干肺重量，觀察小鼠的肺水腫程度;檢查肺組織勻漿中的MPO(髓過氧化物酶活性)活性情況，分析中性粒細胞的活化和浸潤情況;計數肺泡灌洗液中的細胞總數和炎癥細胞的數量，ELISA檢測肺泡灌洗液中炎性細胞因子的濃度，分析安石榴甙對炎癥反應的影響。結果:小鼠肺組織HE染色結果發現，LPS誘導的肺組織炎性細胞浸潤，間質水腫和肺實質的損傷均明顯減輕。不同劑量的安石榴甙可以顯著減低ALI小鼠中濕肺/干肺重量比(P＜0.05)。說明安石榴甙可以減輕ALI導致的肺組織滲出、水腫。不同劑量的安石榴甙可以顯著減少肺泡灌洗液中的炎癥細胞總數以及中性粒細胞和巨噬細胞的數量(P＜0.05)。安石榴甙可明顯降低肺泡灌洗液中的細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度(P＜0.05)。MPO的活性檢測表明，安石榴甙減少了LPS誘導的中性粒細胞在肺組織中的浸潤。結論:安石榴甙在LPS誘導的急性肺損傷中具有明顯的保護作用。

［關鍵詞］安石榴甙;脂多糖;急性肺損傷

①河南省南陽市南陽胸科醫院彩超室，南陽473000。

Protective effects of pomegranate glycosides on LPS-induced acute lung injury to mice

LI Xiao-Juan，HE Shun-Yao.Clinical Laboratory，Nanyang Chest Hospital，Nanyang 473000，China

［Abstract］Objective: To investigate the protective effect of punicalagin in LPS induced ALI.Methods: ALI mice model was induced by intraperitoneal injection of LSP(20 mg/kg bodyweight) to induce acute lung injury in mice.A total of 60 mice were divided into 6 groups，10 rats in each group: normal control group，LPS group，LPS+ punicalagin group (10，20，40 mg/kg bodyweight)，LPS+ dexamethasone group.2 h before LPS injection，punicalagin and dexamethasone were intraperitoneal injection in mice，and then by intraperitoneal injection of a lethal dose of LPS，normal control group mice were given intraperitoneal injection of an equal volume of PBS.HE staining，observed the lung tissue of mice in the different treatment conditions of the pathological changes and the degree of lung injury，weighted the wet lung and dry lung of the mice respectively，observed degree of pulmonary edema in mice，inspect MPO activity of lung homogenate，analyzed the activation and infiltration of polymorphonuclear，counted the total number of cells and the number of inflammatory cells in alveolar lavage fluid，detected the concentration of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid with ELISA，and analyzed the impact of punicalagin on inflammation of lung tissue.Results: HE staining of lung tissue in mice and found that the LPS-induced lung inflammatory cell infiltration，interstitial edema and pulmonary parenchymal damage were significantly reduced.Different dose of punicalagin could significantly reduce the lung wet/dry lung weight ratio of ALI in mice (P＜0.05) .Punicalagin ALI could reduce lung tissue caused exudation，edema.The different doses of punicalagin could significantly reduce the inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid，the sum of the number of neutrophils and macrophages (P＜0.05) .Punicalagin could significantly reduce the concentration in the bronchoalveolar lavage cytokines IL-6，IL-12，TNF-α and IL-1β(P＜0.05) .The MPO activity was detected that punicalagin reduce neutrophil infiltration induced by LPS in the lung tissue.Conclusion: Punicalagin has protective effects on LPS induced acute lung injury.

［Key words］Punicalagin; Lipopolysaccharide; Acute lung injury

急性肺損傷是由于心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性進行性缺氧性呼吸衰竭，臨床上是以非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥為特征的一種綜合征［1］。急性肺損傷作為一種嚴重的疾病仍然具有30%～40%的死亡率，若伴有膿毒癥病死率高達90%［2，3］。截至目前報道，急性肺損傷若同時并發4個以上臟器功能障礙，則病死率為100%［4，5］。因此，探索治療急性肺損傷的有效措施和特效藥物是非常必要和迫切的。安石榴甙是從石榴科植物中提取的一種多酚類活性成分。近幾年來研究發現，安石榴甙具有很強的抗氧化、抗增殖和抑制腫瘤的作用，以及對抗動脈粥樣硬化和抗炎癥功能［6-8］。在原代培養的軟骨細胞，安石榴甙抑制了LPS誘導的炎癥反應［9］。安石榴甙可以抑制LPS誘導的炎癥反應，那么是否可以將其用于LPS誘導的急性肺損傷的治療目前還不清楚。本研究就是通過應用安石榴甙治療LPS誘導的急性肺損傷，觀察安石榴甙在急性肺損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1試劑耗材安石榴甙(＞89%)購自北京寰宇科創生物公司，LPS(Escherichia coli O55: B5)購自Sigma公司，細胞因子ELISA檢測試劑盒，髓過氧化物酶檢測試劑盒購自上海酶聯生物公司。

1.1.1實驗動物6～8周齡BALB/c小鼠購自河南省實驗動物中心

1.2實驗方法

1.2.1 ALI小鼠模型的制備隨機將60只BALB/ c小鼠分為6組，每組10只:正常對照組，LPS組，LPS+安石榴甙組(10、20、40 mg/kg體重)，LPS+地塞米松組。安石榴甙和地塞米松均在注射LPS前2 h腹腔注射給藥，然后小鼠再腹腔注射致死量的LPS(20 mg/kg體重)誘導急性肺損傷。正常對照組小鼠只給予腹腔注射等體積的PBS。LPS注射7 h后，處死小鼠，解剖小鼠取肺臟，收集小鼠支氣管肺泡灌洗液。

1.2.2肺組織滲出程度檢測(濕肺/干肺重量比)

(1)斷頸處死小鼠，解剖小鼠，分離獲取小鼠肺臟。(2)稱重記錄每只小鼠左肺濕肺重量。(3)然后，將左肺置于80℃烤箱內烘烤48 h，直至肺臟完全失去水分，稱重獲得干肺重量。(4)計算濕肺/干肺的比例評估肺組織水腫的程度。

1.2.3肺臟HE染色(1)將取出的右肺切取一部分放入4%多聚甲醛中固定。(2)將固定過的標本放入脫水機中脫水、透明、浸蠟。(3)經以上處理后將標本進行包埋、切片、染色。(4)用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。

1.2.4 MPO活性檢測(1)取肺組織100 mg加0.5%CTAB溶液1 ml; (2)用玻璃勻漿器制備勻漿，反復凍融(－80℃/37℃)三次; (3) 4℃條件下，3 000 r/min離心15 min; (4)取0.1 ml上清加反應液2.9 ml; (5)保持溫度25°C，立即置分光光度計在460 mm波長下進行2 min時間掃描。以第30秒到第90秒的1 min內吸光度的變化代表酶活力的改變。1單位MPO活力以25℃時分解1 mmol過氧化氫來表示。

1.2.5支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞計數(1)收集支氣管肺泡灌洗液，3 000 r/min，4℃離心10 min; (2)棄去上清，50 μl PBS重懸細胞; (3) Giemsa染色，采用血細胞計數器計數支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數和白細胞分類計數。

1.2.6 ELISA檢測細胞因子濃度根據細胞因子ELISA檢測試劑盒說明書中的方法，分別檢測各組小鼠肺泡灌洗液中炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α 和IL-1β的濃度。

1.3統計學分析所有的數據用x ±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行統計學分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2　結果

圖1　安石榴甙對LPS誘導的ALT肺臟組織病理變化的影響Fig．1 An punicalagin influence on LPS-induced ALI pathological changes in lung tissue

Note: A.Normal control group; B.LPS group; C.LPS +dexamethasone group; D－F.LPS+punicalagin group(10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg) .

2.1安石榴甙對LPS誘導的ALI肺臟組織病理變化的影響小鼠肺組織HE染色，結果發現，對照組肺臟表現為正常的組織結構和形態特征，LPS組肺臟顯示大面積炎性細胞的浸潤，肺泡上皮完整性破壞和肺實質的損傷。然而，不同劑量的安石榴甙組LPS誘導的肺組織病理損失均明顯減輕，這和地塞米松具有同樣的治療效果(圖1)。

2.2安石榴甙抑制LPS誘導的濕肺/干肺重量比

通過稱量ALI小鼠經過不同處理后的肺臟重量，計算肺的濕肺/干肺重量比觀察肺組織滲出、水腫的情況。結果表明，和正常對照組相比(濕肺的重量是干肺重量的約4倍)，LPS處理后，肺組織的滲出和水腫非常明顯，濕肺的重量是干肺重量的約8倍。而不同劑量的安石榴甙或者地塞米松預處理后顯著減低ALI小鼠中濕肺/干肺重量比(P＜0.05)。說明安石榴甙可以減輕由于LPS刺激所導致肺組織滲出、水腫。

2.3安石榴甙減少肺組織灌洗液中的炎癥細胞注射LPS 7 h后，收集肺組織灌洗液中的細胞，計數灌洗液中的細胞總數和中性粒細胞、巨噬細胞的數量。如圖3所示，相對于正常對照組，注射LPS后可以顯著提高肺泡灌洗液中的總炎癥細胞數量，以及中性粒細胞和巨噬細胞的數量。但是，不同劑量的安石榴甙和地塞米松可以顯著減少肺泡灌洗液中的炎癥細胞總數以及中性粒細胞和巨噬細胞的數量(圖3)，差異有統計學意義(P＜0.05)。

Note: * .P＜0.05.

圖3　安石榴甙減少肺組織灌洗液中的炎癥細胞Fig．3 An punicalagin can reduce inflammatory cells in lung tissue lavage fluid

Note: * .P＜0.05.

2.4安石榴甙減少促炎細胞因子的分泌LPS注射后7 h，ELISA檢測肺泡灌洗液中細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度。結果表明，LPS處理后，肺泡灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度顯著升高。但是，安石榴甙可明顯降低肺泡灌洗液中的細胞因子濃度(P＜0.05)，而且這種作用具有劑量依賴性，隨著濃度的增加，安石榴甙對炎性細胞因子的抑制作用更加明顯(圖4)。

2.5安石榴甙抑制LPS導致的MPO活性增加

MPO的活性是中性粒細胞浸潤的可信標志。如圖5所示，相對于正常對照組，LPS刺激后顯著增加了MPO的活性。而安石榴甙組和地塞米松組中LPS引起的MPO的活性增強被明顯抑制(P＜0.05)。說明安石榴甙減少了LPS誘導的中性粒細胞在肺組織中的浸潤。

Note: * .P＜0.05.

3　討論

LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的一種成分，LPS進入肺組織后，可激發機體強烈的炎癥反應導致急性肺損傷［10］。炎癥反應引起的組織損傷是急性肺損傷的重要病理基礎，而局部炎癥的特征性標志是細胞的大量聚集，眾多細胞因子在中性粒細胞聚集過程中起了重要作用［11］。MPO是中性粒細胞的一種酶，其水平和活性直接反映了中性粒細胞的功能和活化狀態［12］。急性肺損傷常伴隨有炎癥反應及多種炎性細胞因子的釋放，引起中性粒細胞的浸潤。肺泡灌洗液中白細胞計數和肺組織中MPO可間接

反映肺內中性粒細胞的滲出和積聚量［13，14］。本研究中安石榴甙的使用劑量主要根據Jean-Gilles等人的研究成果［15］。本研究結果表明，安石榴甙可以減輕LPS導致的肺組織的損傷，可以減輕肺組織的滲出和水腫;明顯減少了支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞總數及中性粒細胞和巨噬細胞的數量;可顯著減低肺泡灌洗液中細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的濃度;減少了中性粒細胞在肺組織中的浸潤。綜上所述，安石榴甙對LPS誘導的急性肺損傷具有保護作用，但是安石榴甙在急性肺損傷中的治療劑量和不良反應，有待進一步研究。可望將安石榴甙開發成為一類新的急性肺損傷保護劑而應用于臨床疾病的治療。

參考文獻:

［1］錢桂生.急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征研究現狀與展望［J］．解放軍醫學雜志，2009，34 (4) : 371-373.

［2］Dushianthan A，Grocott M，Postle AD，et al．Acute respiratory distress syndrome and acute lung injury［J］．Postgrad Med J，2011，87(1031) : 612-622.

［3］Charalampos P，Menelaos K，Sabino S，et al．Acute respiratory distress syndrome: pathophysiology and therapeutic options［J］．J Clin Med Res，2011，4(1) : 7-16.

［4］Tasaka S.Acute lung injury /acute respiratory distress syndrome: progress in diagnosis and treatment.topics: I.Pathogenesis and pathophysiology; 2.Pathogenesis and pathophysiology of ALI/ARDS ［J］．Nihon Naika Gakkai Zasshi，2011，100 (6) : 1529-1535.

［5］Matthay MA，Zimmerman GA，Esmon C，et al.Future research directions in acute lung injury: summary of a normal heart，lung and blood institute working group［J］．Am J Respir Crit Care Med，2003，167(7) : 1027.

［6］Seeram NP，Adams LS，Henning SM，et al．In vitro antiproliferative，apoptotic and antioxidantactivities of punicalagin，ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice ［J］．J Nutritional Biochemistry，2005，16: 360-367.

［7］Cerda B，Llorach R，Ceron JJ，et al．Evaluation of the bioavailability and metabolism in the rat of punicalagin，an antioxidant polyphenol from pomegranate juice［J］．Euro J Nutrition，2003，42: 18-28.

［8］Lin CC，Hsu YF，Lin TC.Effects of punicalagin and punicalin on carrageenan-induced inflammation in rats［J］．Am J Chin Med，1999，27: 371-376.

［9］Lee C，Chen L，Wang C.Anti-inflammatory effects of Punica granatum Linne in LPS-induced primary human chondrocytes［J］．Planta Med，2010，76: 1376-1376.

［10］Mei SH，McCarter SD，et al．Prevention of LPS-induced acute lung injury in mice by mesenchymal stem cells overexpressing angiopoietin 1［J］．PLoS Med，2007，4: e269.

［11］Wynn JL，Wong HR.Pathophysiology and treatment of septic shock in neonates［J］．Clin Perinatol，2010，37(2) : 439-479.

［12］Mori T，Town T，Tan J，et al.Modulation of astrocytic activation by arundic acid mitigates detrimental eflbcts of the apolipoprotein E4 isoform after permanent focal ischemia in apolipopmtein E knockin mice［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2005，25 (6) : 748.

［13］Lee WL，Downey GP.Neutrophil activation and acute lung injury ［J］．Current Opinion in Critical Care，2001，7: 1-7.

［14］Zmijewski JW，Lorne E，et al．Antiinflammatory effects of hydrogen peroxide in neutrophil activation and acute lung injury ［J］．Am J Respirat Crit Care Med，2009，179(8) : 694-704.

［15］Jean-Gilles D，Li L，Vaidyanathan VG，et al．Inhibitory effects of polyphenol punicalagin on type-II collagen degradation in vitro and inflammation in vivo［J］．Chemico-Biological Interactions，2013，205: 90-99.

［收稿2015-02-14修回2015-03-18］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．007

作者簡介:李曉娟(1974年－)，女，檢驗科主任，副主任檢驗師，主要從事臨床檢驗方面的研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1329-04

文獻標志碼A

中圖分類號R392.9