被動免疫治療過敏性鼻炎豚鼠對炎癥細胞因子的影響①

朱喜玲　周文蕓張海玲　翟精武　孫翠英　常　秋　文　珠胡國柱(安順學院農學院，安順561000)

?

被動免疫治療過敏性鼻炎豚鼠對炎癥細胞因子的影響①

朱喜玲周文蕓②張海玲翟精武孫翠英常秋文珠③胡國柱②(安順學院農學院，安順561000)

［摘要］目的:探討抗IL-1β和TNF-α IgY滴鼻治療過敏性鼻炎豚鼠對炎癥細胞因子的影響。方法:應用卵清白蛋白

(OVA)建立豚鼠過敏性鼻炎模型。將豚鼠隨機分為:正常對照組(C組，17只)，模型組(M組，27只)，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組，21只)，丙酸氟替卡松治療組(Z2組，21只)。分別在治療后2、4、8 h心臟取血，鼻灌洗收集鼻灌洗液(NLF)，ELISA法測定細胞因子水平。結果:在外周血，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組2～8 h時IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-33和TGF-β1，2～4 h時TNF-α和OVA特異性IgE，以及4～8 h時IL-22等水平均顯著低于模型組(P＜0.05)。在鼻灌洗液中，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組2～8 h時IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TNF-α、TGF-β1和OVA特異性IgE，以及2 h時IL-18等水平顯著低于模型組(P＜0.05)。結論:過敏性鼻炎豚鼠采用抗IL-1β和TNF-α IgY滴鼻治療能顯著地降低炎癥因子水平。

［關鍵詞］過敏性鼻炎;豚鼠;卵白蛋白;腫瘤壞死因子;白細胞介素-1β;細胞因子

①本文為江西省科技廳社會發展重大招標課題(2006第四批)。

②江西省人民醫院，南昌330006。

③江西省醫學科學研究院血液研究室，南昌330006。

Influence on inflammation cytokines in passive immunotherapy for allergic rhinitis guinea pigs

ZHU Xi-Ling，ZHOU Wen-Yun，ZHANG Hai-Ling，ZHAI Jing-Wu，SUN Cui-Ying，CHANG Qiu，WEN Zhu，HU Guo-Zhu.Agricultural College，Anshun College，Anshun 561000，China

［Abstract］Objective: To explore the influence on inflammation cytokines for anti-IL-1β and TNF-α IgY intranasal treatment in guinea pigs with allergic rhinitis.Methods: The allergic rhinitis model in guinea pigs was established using ovalbumin(OVA) .Hartley guinea pigs were randomly divided into the control group(group C，n = 17)，the allergic rhinitis model group(group M，n = 27)，the 0.1% anti-IL-1β and TNF-α IgY treatment group(group Z1，n=21) and the fluticasone propionate treatment group(group Z2，n=21)．At 2 h，4 h and 8 h after the last treatment，blood was got by heart puncture，as well as nose was lavaged using 0.9% saline and the nasal lavage fluid(NLF) was collected.The level of cytokines was examined using ELISA kits.Results: In the peripheral blood，the levels of IL-1β，IL-5，IL-9，IL-13，IL-18，IL-33 and TGF-β1 from 2 h to 8 h; TNF-α and OVA-specific IgE from 2 h to 4 h; and IL-22 from 4 h to 8 h were significantly decreased in the 0.1% anti-IL-1β and TNF-α IgY treatment group compared with the allergic rhinitis model group(P＜0.05) .In the NLF，the levels of IL-1β，IL-5，IL-9，IL-13，IL-22，IL-33，TNF-α，TGF-β1 and OVA-specific IgE from 2 h to 8 h; and IL-18 at 2 h were significantly decreased in the 0.1% anti-IL-1β and TNF-α IgY treatment group compared with the allergic rhinitis model group(P＜0.05) .Conclusion: Anti-IL-1β and TNF-α IgY intranasal treatment can significantly reduce inflammation cytokine levels in allergic rhinitis guinea pigs.

［Key words］Allergic rhinitis; Guinea pigs; Ovalbuamin; TNF-α; IL-1β; Cytokines

在過敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)，當機體再次暴露于抗原2 h至24 h后即出現晚期反應［1，2］。卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)誘導的過敏性鼻炎豚鼠和小鼠，及過敏性鼻炎患者其血清和鼻灌洗液中IgE、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TNF-α和嗜酸性陽離子蛋白-1水平顯著升高［1，3-8］。我們前期研究證明，抗TNF-α和IL-1β IgY顯著減少和減輕過敏性鼻炎豚鼠鼻黏膜嗜酸性粒細胞浸潤和炎癥病理反應，減少NLF中嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞，降低鼻黏膜IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達［9］。本文觀察抗IL-1β和TNF-α IgY滴鼻被動免疫治療過敏性鼻炎豚鼠，探討其對炎癥因子和Th2細胞因子的影響，以期為過敏性鼻炎的臨床治療尋找新的有效途徑。

1　材料與方法

1.1材料Hartley豚鼠，雄性，7周齡，體重(200± 50) g，購自上海嚙齒類動物研究中心，許可證號: SXCK(滬) 2012-0008。抗TNF-α和IL-1β IgY(純度85%，效價1∶3 200/mg蛋白) ;丙酸氟替卡松(濃度0.05%，英國Glaxsmithk公司) ;卵清白蛋白(Sigma公司) ;氫氧化鋁凝膠(美國Thermo scientific公司) ; IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TNF-α、TGF-β1、OVA特異性IgE ELISA試劑盒(中國上海西塘生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1豚鼠過敏性鼻炎模型建立133只豚鼠根據體重隨機分成正常對照組(C組，17只)和過敏性鼻炎模型建立組(116只)。建立豚鼠過敏性鼻炎模型方法見文獻［10］。簡言之，正常對照組(C組)基礎免疫和加強免疫(激發)均采用每側鼻孔滴注0.1 ml生理鹽水。建立過敏性鼻炎模型(116只)基礎致敏時腹腔注射1 ml的0.03% OVA + 3.0%氫氧化鋁，隔日1次，共7次;然后采用OVA皮內注射法鑒定豚鼠致敏是否成功;致敏成功的豚鼠休息7 d后，采用2.0%OVA滴鼻激發3次(0.1 ml /每側鼻孔，每天1次)，然后根據豚鼠(剩余69只)過敏癥狀評分結果隨機分成模型組(M組，n = 27)，0.1 ml生理鹽水滴鼻后再滴鼻2.0%OVA激發; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組，n = 21)，0.1 ml 0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY滴鼻后再滴鼻2.0% OVA激發;丙酸氟替卡松治療組(Z2組，n = 21)，0.1 ml丙酸氟替卡松滴鼻后再滴鼻2.0%OVA激發;每天1次，共7次。OVA攻擊10次后M組死亡6只(剩21只)，Z1組死亡2只(剩19只)，Z2組死亡5只(剩16只)。

1.2.2鼻灌洗及鼻灌洗液收集治療結束后每組豚鼠分別在2 h、4 h或8 h時間點各取數只豚鼠進行鼻灌洗及收集鼻灌洗液。鼻灌洗及鼻灌洗液收集操作參照Bahekar等人［10］方法。操作簡述如下: 10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉豚鼠，豚鼠仰頭向上并固定，小塑料管插入一個鼻孔，使用5.0 ml注射器吸取2 ml生理鹽水慢慢推注(0.1 ml/min)沖洗鼻腔，從另一個鼻孔用微量取樣器吸出鼻灌洗液(NLF)，然后離心2 500 r/min，10 min，取上清液即為NLF，儲存于－80℃。

1.2.3心臟采血治療結束后在2 h、4 h或8 h時間點各取數只豚鼠在鼻灌洗及收集鼻灌洗液之后，開胸暴露出心臟，使用5.0 ml注射器心臟穿刺抽血置EDTA抗凝管，離心2 500 r/min，10 min，取血漿至－80℃保存。

1.2.4細胞因子測定血漿和鼻灌洗液中IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TNF-α、TGF-β1 和OVA特異性IgE水平采用雙抗夾心ELISA法測定，操作步驟嚴格按試劑盒操作說明書進行，通過試劑盒標準品所做的標準曲線計算出細胞因子濃度。

1.3統計學分析實驗結果采用SPSS19.0軟件包進行統計分析，數據采用x ±s表示，各組樣本均數間比較采用One-way ANOVA分析，若方差齊性，采用LSD法比較兩組之間差異;若方差不齊性，采用多重秩和檢驗，多重比較采用Mann-Whiteney法，以P＜0.05表示差異有顯著性。

2　結果

2.1外周血細胞因子濃度變化在外周血，0.1% 抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、L-18、IL-33、TGF-β等細胞因子，2～4 h時TNF-α和OVA特異性IgE，4～8 h時IL-22等細胞因子含量顯著低于過敏性鼻炎豚鼠模型組(M組) (P＜0.05) (表1) ; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組)與丙酸氟替卡松治療組(Z2組)比較無顯著性差異(P＞0.05) (表1) ; 0.1% 抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時TNF-α、IL-18，2～4 h時TGF-β，4～8 h時OVA特異性IgE，2 h和8 h時IL-13，此外2 h時IL-5、4 h時IL-22、8 h時IL-9等細胞因子含量與正常對照組(C 組)無顯著差異(P＞0.05) (表1)。

2.2鼻灌洗液細胞因子濃度變化在鼻灌洗液中，0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TGF-β、OVA特異性IgE，2 h時IL-18等細胞因子含量顯著低于過敏性鼻炎豚鼠模型組(M組) (P＜0.05) (表2) ; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組)與丙酸氟替卡松治療組(Z2組)比較無顯著性差異(P＞0.05)(表2) ; 0.1%抗IL-1β和TNF-α IgY治療組(Z1組) 2～8 h時TNF-α、IL-5、OVA-特異性IgE，2～4 h時IL-9、IL-33，2 h和8 h時IL-22，4～8 h時IL-1β，4 h時IL-13，8 h時TGF-β等細胞因子含量與正常對照組(C 組)無顯著差異(P＞0.05) (表2)。

表1　各組過敏性鼻炎豚鼠外周血炎癥細胞因子水平(x±s)Tab．1 Levels of inflammation cytokines in PB in guinea pigs with allergic rhinitis after different treatment groups(x±s)

表2　各組過敏性鼻炎豚鼠鼻灌洗液炎癥細胞因子水平(x ±s)Tab．2 Levels of inflammation cytokines in NLF in guinea pigs with allergic rhinitis after different treatment groups(x±s)

(續表2)

3　討論

OVA誘導的豚鼠和小鼠，以及人類過敏性鼻炎患者血清中總IgE和OVA特異性IgE、TNF-α、IL-9、IL-18、IL-22、IL-33含量顯著增加;鼻灌洗液中OVA特異性IgE、IL-5、IL-13、IL-33、IL-18、TGF-β含量顯著增加。本文也證明，OVA誘導的過敏性鼻炎豚鼠IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-22、IL-33、TGF-β等前炎癥因子和炎癥因子，IL-5、IL-9、IL-13等Th2細胞因子，以及OVA特異性IgE含量在外周血和鼻灌洗液中顯著增加(表1、2)。然而滴鼻給予過敏性鼻炎模型豚鼠抗IL-1β和TNF-α IgY治療后，外周血OVA特異性IgE、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、L-33、TGF-β含量顯著降低(P＜0.05) (表1)。Iwasaki等［11］也證明OVA誘導的過敏性鼻炎TNF-α (-/-)小鼠血清OVA特異性IgE含量減少。抗IL-33抗體治療OVA誘導的過敏性鼻炎小鼠也減少了血清總IgE和OVA特異性IgE含量［12，13］。本文滴鼻給予過敏性鼻炎模型豚鼠抗IL-1β和TNF-α IgY治療后，鼻灌洗液中OVA特異性IgE、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TGF-β含量顯著降低(P＜0.05) (表2)。本文研究還提示，抗IL-1β和TNF-α IgY降低炎癥因子及Th2細胞因子的療效與丙酸氟替卡松(糖皮質激素)無顯著性差異(P＜0.05) (表1、2)。值得注意的是鼻灌洗液中IL-18含量僅僅是在治療后2 h下降，而4～8 h則高于模型組豚鼠。Salagianni等［14］發現IL-18起著抑制IgE產生的作用。在體外IL-18與IL-12輔助促進Th1/ Tc1發展，抑制向Th2/Tc2分化。IL-18(-/-)小鼠與野生型正常小鼠比較，經OVA免疫后IL-18(-/-)小鼠表現出高IgE和IgG1水平。這個結果提示，經抗IL-1β和TNF-α IgY治療后IL-18升高可能是有利于疾病的恢復，因為其可能抑制Th2細胞因子產生。

TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33、TGF-β等細胞因子參與了過敏性炎癥病理反應的發生和發展，并且這些細胞因子相互作用刺激其進一步增加，從而加重炎癥病理反應。例如: IL-9刺激人氣道平滑肌細胞釋放Th2相關的趨化因子(eotaxin1/CCL11)［15］。哮喘患者IL-13刺激氣道纖維母細胞產生TGF-β1導致氣道重塑［16］。在過敏性鼻炎小鼠，IL-33刺激鼻黏膜分泌IL-4、IL-5、IL-13［17］。IL-33誘導IL-13產生的2型固有淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cells)擴增［18］。OVA與IL-1β或IL-33一道作用于OVA致敏的小鼠氣道使其產生IgE［19］。致敏的動物氣道暴露于致敏原引起ATP和尿酸釋放，激活NLRP3炎癥體復合物，其裂解IL-1β原成為成熟的IL-1β［20］。人鼻黏膜纖維母細胞暴露于IL-1β或TNF-α增加了IL-33產生［21］，而TNF-α刺激哮喘患者的氣道平滑肌細胞上調IL-33表達［22］。Mo等［23］證明抗TNF-α處理過敏性鼻炎小鼠減輕了其過敏癥狀，降低了總的和OVA特異性IgE水平，以及減少了IL-4的產生。本研究的結果提示前炎癥因子IL-1β和TNF-α在過敏性炎癥病理反應細胞因子相互作用程序中先于IL-33，并且在過敏性炎癥的炎癥細胞因子反應網絡中IL-1β和TNF-α處于細胞因子相互作用的起始端。因此，采用抗IL-1β和TNF-α IgY局部阻斷IL-1β和TNF-α能更有效地抑制過敏性炎癥病理反應，且避免糖皮質激素帶來的不良反應，其可能是一種潛在而有效的生物學治療新手段。

參考文獻:

［1］Thakare VN，Osama MM，Naik SR.Therapeutic potential of curcumin in experimentally induced allergic rhinitis in guinea pigs［J］．Int Immunopharmacol，2013，17(1) : 18-25.

［2］Galli SJ，Tsai M，Piliponsky AM.The development of allergic inflammation［J］．Nature，2008，454(7293) : 445-454.

［3］Daoud A，Xie Z，Ma Y，et al．Changes of T-helper type 1/2 cell balance by anticholinergic treatment in allergic mice［J］．Ann Allergy Asthma Immunol，2014，112(3) : 249-255.

［4］Boghdadi G，Marei A，Ali A，et al．Immunological markers in allergic rhinitis patients treated with date palm immunotherapy［J］．Inflamm Res，2012，61(7) : 719-724.

［5］Kamekura R，Kojima T，Takano K，et al．The role of IL-33 and its receptor ST2 in human nasal epithelium with allergic rhinitis［J］．Clin Exp Allergy，2012，42(2) : 218-228.

［6］Verhaeghe B，Gevaert P，Holtappels G，et al．Up-regulation of IL-18 in allergic rhinitis［J］．Allergy，2002，57(9) : 825-830.

［7］Asaka D，Yoshikawa M，Nakayama T，et al．Elevated levels of interleukin-33 in the nasal secretions of patients with allergic rhinitis ［J］．Int Arch Allergy Immunol，2012，158(Suppl 1) : 47-50.

［8］Farfariello V，Amantini C，Nabissi M，et al．IL-22 mRNA in peripheral blood mononuclear cells from allergic rhinitic and asthmatic pediatric patients［J］．Pediatr Allergy Immunol，2011，22 (4) : 419-423.

［9］朱喜玲，胡微煦，吳梨華，等.抗TNF-α和IL-1β IgY抗體治療

豚鼠過敏性鼻炎機理研究［J］．中國免疫學雜志，2014，30 (10) : 1353-1359.

［10］Baheka PC，Shah jh，Ayer UB，et al．Validation of guinea pig model of allergic rhinitis by oral and topical drugs［J］．Immunopharmacol，2008，8(11) : 1540-1551.

［11］Iwasaki M，Saito K，Takemura M，et al．TNF-alpha contributes to the development of allergic rhinitis in mice［J］．J Allergy Clin Immunol，2003，112(1) : 134-140.

［12］Kim YH，Yang TY，Park CS，et al．Anti-IL-33 antibody has a therapeutic effect in a murine model of allergic rhinitis［J］．Allergy，2012，67(2) : 183-190.

［13］Liu X，Li M，Wu Y，et al．Anti-IL-33 antibody treatment inhibits airway inflammation in a murine model of allergic asthma［J］．Biochem Biophys Res Commun，2009，386(1) : 181-185.

［14］Salagianni M，Wong KL，Thomas MJ，et al．An essential role for IL-18 in CD8 T cell-mediated suppression of IgE responses［J］．J Immunol，2007，178(8) : 4771-4778.

［15］Gounni AS，Hamid Q，Rahman SM，et al．IL-9-mediated induction of eotaxin1/CCL11 in human airway smooth muscle cells［J］．J Immunol，2004，173(4) : 2771-2779.

［16］Firszt R，Francisco D，Church TD，et al．Interleukin-13 induces collagen type-1 expression through matrix metalloproteinase-2 and transforming growth factor-β1 in airway fibroblasts in asthma［J］．Eur Respir J，2014，43(2) : 464-473.

［17］Lin L，Zhao X，Yan W，et al．Amelioration of Muc5b mucin hypersecretion is enhanced by IL-33 after 2-APB administration in a murine model of allergic rhinitis［J］．Biotech Histochem，2014，89 (4) : 273-286.

［18］Barlow JL，Peel S，Fox J，et al．IL-33 is more potent than IL-25 in provoking IL-13-producing nuocytes (type 2 innate lymphoid cells) and airway contraction［J］．J Allergy Clin Immunol，2013，132(4) : 933-941.

［19］Kobayashi T，Iijima K，Checkel JL，et al．IL-1 family cytokines drive Th2 and Th17 cells to innocuous airborne antigens［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49(6) : 989-998.

［20］Besnard AG，Togbe D，Couillin I，et al．Inflammasome-IL-1-Th17 response in allergic lung inflammation［J］．J Mol Cell Biol，2012，4(1) : 3-10.

［21］Nomura K，Kojima T，Fuchimoto J，et al．Regulation of interleukin-33 and thymic stromal lymphopoietin in human nasal fibroblasts by proinflammatory cytokines［J］．Laryngoscope，2012，122(6) : 1185-1192.

［22］Préfontaine D，Lajoie-Kadoch S，Foley S，et al．Increased expression of IL-33 in severe asthma: evidence of expression by airway smooth muscle cells［J］．J Immunol.2009，183 (8) : 5094-5103.

［23］Mo JH，Kang EK，Quan SH，et al．Anti-tumor necrosis factor-alpha treatment reduces allergic responses in an allergic rhinitis mouse model［J］．Allergy，2011，66(2) : 279-286.

［收稿2015-04-17修回2015-05-13］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．012

通訊作者及指導教師:胡國柱(1956年－)，男，研究員，碩士生導師，主要從事免疫學研究，E-mail: hgz56@126.com。

作者簡介:朱喜玲(1988年－)，女，主要從事免疫治療學研究。

文章編號1000-484X(2015) 10-1352-05

文獻標志碼A

中圖分類號R392