當歸補血湯對骨髓輻射損傷過程中NF-κB及bax、bcl-2表達的影響

當歸補血湯對骨髓輻射損傷過程中NF-κB及bax、bcl-2表達的影響

王曉玲趙舒武王媛媛1王娟娟1汪濤

(天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津300193)

摘要〔〕目的觀察當歸補血湯對骨髓輻射損傷過程中核因子(NF)-κB及下游因子bax、bcl-2表達的影響。方法取原代培養(yǎng)7 d的骨髓基質細胞用137Cs-γ射線(4 Gy)照射，在照射后24 h用含不同劑量的當歸補血湯載藥血清干預24 h；小鼠同劑量γ射線照射后，灌胃給藥同劑量的當歸補血湯1 w，處死小鼠取骨髓。應用免疫熒光技術，real-time RT-PCR分別檢測輻射損傷骨髓基質細胞模型和小鼠模型骨髓的NF-κB及下游因子bax、bcl-2的表達。結果輻射可激活NF-κB信號，啟動MSC和骨髓細胞凋亡過程。經(jīng)當歸補血湯干預，MSC和骨髓細胞內可下調NF-κB基因的表達，但隨著藥物劑量加大下調趨勢減緩(P<0.05)；當MSC和骨髓細胞內bcl-2/bax比值升高時，對促凋亡信號敏感性減弱，表現(xiàn)出抗凋亡的特點，細胞存活壽命延長(P<0.05)。結論當歸補血湯可通過影響NF-κB的表達調節(jié)bcl-2/bax，減少骨髓內細胞凋亡，有利于輻射損傷后機體造血免疫機能的恢復。

關鍵詞〔〕當歸補血湯；輻射損傷；骨髓；凋亡

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81273892)；天津市高等學校科技發(fā)展基金計劃項目(20100205)；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結合科研課題(11030)

通訊作者：汪濤(1961-)，女，教授，碩士生導師，主要從事干細胞生物學研究。

1天津中醫(yī)藥大學護理學院

第一作者：王曉玲(1976-)，女，副教授，博士，碩士生導師，主要從事中藥防治輻射損傷機制研究。

Effect of Danggui buxue decoction on NF-kappa B and its downstream molecule bax and bcl-2 expressions of mouse bone marrow in the process of radiation damage

WANG Xiao-Ling, ZHAO Shu-Wu, WANG Yuan-Yuan,etal.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Danggui buxue decoction on inhibiting bone marrow from apoptosis.MethodsBone marrow stromal cells (BMSCs) from mice were primary cultured for 7 days and then radiated by 137Cs-gamma ray (4 Gy). After irradiation for 24 h, BMSCs were cultured in the different concentration serum containing drug of Danggui buxue decoction for 24 h. After radiated by the same dose of gamma ray, mice were given the same dose of Danggui buxue decoction by intragastric administration for one week, and then sacrificed and extracted bone marrow. NF-kappa B and its downstream molecule bax and bcl-2 expressions of BMSCs and mice bone marrow radiated by gamma ray were detected separately by immunofluorescence technique and real-time fluorescence quantitative RT-PCR method.ResultsNF-kappa B signal activated by radiation could start the process of BMSCs and bone marrow cells apoptosis. BMSCs and bone marrow cells down regulated the expression of NF-kappa B after the intervention of Danggui buxue decoction; but with dose increasing, a downward trend was slowed (P<0.05). When the bcl-2/bax ratio increasing in BMSCs and bone marrow cells, the apoptotic signals sensitivity was decreased and cells showed the anti-apoptotic specialty and life extension(P<0.05).ConclusionsDanggui buxue decoction could affect the expression of NF-kappa B and then adjust the bcl-2/bax ratio in order to reduce cell apoptosis in bone marrow radiated by gamma ray, and furthermore is conducive to the recovery of hemopoiesis and immune function after radiation injury.

【Key words】Danggui buxue decoction; Radiation damage; Bone marrow; Apoptosis

骨髓功能障礙是輻射對人體造成的主要傷害之一，電離輻射不僅可損傷骨髓內增殖活躍的造血細胞，同時也可對骨髓造血微環(huán)境造成一定程度的傷害。骨髓基質細胞(MSC)是構成造血微環(huán)境的重要組成部分，主要包括成纖維細胞、巨噬細胞、網(wǎng)狀細胞、內皮細胞及脂肪細胞等。輻射屬于外感熱毒邪毒，可直中臟腑、傷陰和致氣血不足，其基本病機是氣血兩虛及血淤，故骨髓輻射損傷屬于中醫(yī)“虛勞”、“氣血虛”病癥。出自金元時代李東垣的《內外傷辨惑論》的當歸補血湯是補益氣血的代表方，具有補氣生血之功效，主治勞倦內傷、氣血虛弱諸癥。現(xiàn)代藥理學研究表明當歸補血湯具有益氣補血、滋補排毒、抗輻射的功效，但具體的作用機制尚未明確。本實驗主要探討當歸補血湯對抗輻射致細胞凋亡的分子機制。

1材料與方法

1.1動物SD大鼠60只，體重(200±15)g；昆明種小鼠100只，體重(20±0.5)g，雌雄不限，均購于中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心，動物許可證號：scxk2005-0001。

1.2試劑DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)、特級胎牛血清(Hyclon公司)、MTT(Sigma公司)；NF-κB、bax、bcl-2兔多克隆抗體(Santa cruz公司)、FITC標記山羊抗兔IgG二抗(Immunoreagents公司)；RNA提取純化試劑盒、RT-qPCR專用反轉錄試劑盒、SYBR Green qRCP試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；當歸，黃芪飲片(天津中新藥業(yè))。

1.3方法

1.3.1不同劑量的當歸補血湯水煎劑及載藥血清的制備依據(jù)當歸補血湯用藥量(36 g飲片·kg-1體重·d-1)及“人和動物體表面積折算法”計算出小鼠臨床等效劑量為4.5 g/kg，3倍劑量為13.5 g/kg，5倍劑量為22.5 g/kg。將中藥復方1劑按照當歸與黃芪1∶5的量浸泡在蒸餾水中，每克中藥加水6 ml，泡30 min。武火煮沸后，文火煎煮30 min，過濾后收集煎液，原渣每克加水4 ml，再煎煮40 min，過濾取煎液，兩者混合，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將大鼠隨機分成4組，其中三組灌胃相當于大鼠臨床等效劑量、3倍劑量、5倍劑量的黃芪當歸合煎液(藥物用量計算依據(jù)同前)，每只6 ml/d，2次/d，連續(xù)給藥4 d，第4天灌胃后禁食，次晨灌服1次，1 h后無菌條件下腹主動脈取血，分離血清，56℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，密封，-20℃凍存。對照血清的制備：每日灌胃同體積的水，血清制法同前。

1.3.2MSC培養(yǎng)、分組及干預無菌條件下取出小鼠雙側股骨，用DMEM/F12培養(yǎng)基沖出骨髓吹打成單細胞懸液，離心后將細胞沉淀用含10%FBS的培養(yǎng)基懸浮，接種于培養(yǎng)板內。24 h后換液，吸出懸浮細胞。此后每隔2 d換液1次。7 d后細胞貼壁生長并基本融合。此時將MSC 經(jīng)137Cs-γ射線(4 Gy)照射5 min(空白對照組不照射)。照射24 h后，除空白對照組外其余細胞均用無血清培養(yǎng)基洗細胞2遍，加入不同劑量的當歸補血湯載藥血清進行干預，24 h后進行指標檢測。細胞分組：①空白對照組：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；②照射組：細胞照射后用含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；③給藥1組：細胞照射后用含10%等效劑量當歸補血湯大鼠載藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；④給藥2組：細胞照射后用含10% 3倍劑量當歸補血湯大鼠載藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)；⑤給藥3組：細胞照射后用含10% 5倍劑量當歸補血湯大鼠載藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.3照射小鼠模型的制作、分組及干預小鼠裝入有機玻璃鼠盒內，經(jīng)4 Gy137Cs-γ射線全身一次性照射5 min(正常組不進行照射)。照射后在無菌層流架內飼養(yǎng)，水、飼料、墊料均經(jīng)高溫高壓消毒。將75只小鼠隨機分為正常組、照射組(僅照射)、給藥1組(照射后給等效劑量的當歸補血湯)、給藥2組(照射后給3倍劑量的當歸補血湯)、給藥3組(照射后給5倍劑量的當歸補血湯)，每組15只。照射后給藥各組每天定時灌胃當歸補血湯0.5 ml/只，持續(xù)7 d，同樣條件下正常組和照射組灌胃生理鹽水，飼養(yǎng)1 w后進行指標檢測。

1.3.4MTT法檢測不同培養(yǎng)條件下MSC的存活率將MSC培養(yǎng)6 d后，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使其同步化，按照實驗分組進行干預，當歸補血湯載藥血清作用24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，加入DMSO150 μl，振蕩10 min，在酶標儀上測定570 nm處光密度(OD)值。

1.3.5免疫熒光顯微技術觀察MSC損傷模型的NF-κB、bcl-2及bax蛋白亞細胞定位將無水甲醇固定的MSC爬片，封閉，分別滴加NF-κB、bcl-2及bax一抗(1∶100)，4℃冰箱過夜，滴加FITC標記的二抗工作液(1∶200)，在濕暗盒內37℃孵育30 min，Hoechst33258工作液染核，漂洗，滴加封片劑封片，暗盒保存，熒光顯微鏡觀察。

1.3.6real time RT-PCR檢測輻射損傷的MSC和小鼠NF-κB、bcl-2及bax mRNA的表達(1)MSC及小鼠骨髓總RNA提取：按照RNA提取純化試劑盒說明書提供的方法提取總RNA，-80℃保存。(2)MSC及小鼠骨髓總RNA反轉合成cDNA：按RT-qPCR反轉錄試劑盒說明書冰上操作，依次加入反應液，逆轉錄條件為：37℃ 15 min(反轉錄反應)；85℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)，4℃冷卻。合成的cDNA 放在-20℃保存。(3)real-time PCR反應：以β-actin作內參照，其序列為(引物擴增長度154 bp)：上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′；NF-κB序列(引物擴增長度111 bp)：上游引物：5′-ATGGCAGACGATGATCCCTAC-3′；下游引物：5′-TGTTGACAGTGGTATTTCTGGTG-3′；bax序列(引物擴增長度137 bp)：上游引物：5′-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3′；下游引物：5′-AATTCGCCGGAGACACTCG-3′；bcl-2序列(引物擴增長度120 bp)：上游引物：5′-ATGCCTTTGTGGAACTATATGGC-3′；下游引物：5′-GGTATGCACCCAGAGTGATGC-3′。PCR反應條件：預變性95℃ 30 s；95℃變性5 s，60℃復性30 s，40個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 s。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1照射后24 h不同培養(yǎng)條件下MSC增殖情況當歸補血湯載藥血清可明顯減少輻射損傷后MSC的凋亡(P<0.05)，但隨著藥物作用濃度增高抗凋亡作用減弱，等效劑量載藥血清抗凋亡效果最佳(P<0.05)。見表1。

表1　照射后24 h不同培養(yǎng)條件對MSC存活的

與照射組相比：1)P<0.05，與空白對照組相比：2)P<0.05

2.2免疫熒光顯微技術觀察MSC輻射損傷后的NF-κB、bcl-2及bax蛋白亞細胞定位在輻射損傷后24 h，NF-κB蛋白主要位于MSC細胞核周圍的胞質內，呈綠色熒光。bcl-2蛋白主要位于MSC胞質內，凋亡的MSC表達程度較弱或不表達，呈較暗的綠色熒光。照射組只有少數(shù)細胞表達，熒光較暗，給藥各組的表達程度強于照射組，熒光亮度較強。bax蛋白在MSC內表達部位及熒光色澤與bcl-2相同，但表達強度的寓意不同，凋亡的MSC表達程度較強。照射組表達細胞數(shù)量多，熒光亮度強，見圖1。給藥組表達的細胞數(shù)量和熒光亮度均弱于照射組。

2.3real-time RT-PCR檢測輻射損傷的MSC和小鼠骨髓NF-κB、bcl-2及bax mRNA的表達在照射24 h后，各實驗組MSC NF-κB的表達相對于空白對照組均明顯下降，給藥各組下調幅度更大，但隨著藥物劑量加大，下調幅度減弱(P<0.05)；各給藥組bcl-2/bax的比值相對于正常組均明顯下降，與照射組相比下降幅度減小，隨著藥物劑量加大下調幅度增加(P<0.05)。見表2。

A:NF-κB的表達；B:bcl-2的表達；C:bax的表達；①照射組；②給藥1組；③給藥2組；④給藥3組 圖1　免疫熒光顯微鏡觀察MSC中NF-κB、bcl-2、bax的表達

組別NF-κBbaxbcl-2正常組1±01)1±01)1±01)照射組0.9431±0.00032)1.8707±0.00042)0.7705±0.00032)給藥1組0.5966±0.00061)2)1.2097±0.00041)2)0.6668±0.00061)2)給藥2組0.5985±0.00071)2)1.1554±0.00061)2)0.5960±0.00031)2)給藥3組0.6294±0.00121)2)1.2479±0.00041)2)0.6419±0.00041)2)

與照射組比較：1)P<0.05；與正常組比較：2)P<0.05；下表同

在照射1 w后，除給藥1組變低之外，其余各組小鼠骨髓NF-κB的表達均明顯增高，隨著小鼠灌胃藥物劑量加大，表達上調明顯(P<0.05)；各給藥組小鼠骨髓bcl-2/bax的比值相對于正常組明顯上升，與照射組相比各給藥組bcl-2/bax比值均上升，隨著藥物劑量加大，上升幅度增加(P<0.05)。見表3。

表3　照射1 w后各組骨髓NF-κB、bax及

3討論

當歸補血湯由黃芪、當歸兩味藥以5∶1配伍而成，當歸、黃芪中含有多種有效成分如當歸多糖、黃芪多糖、阿魏酸、黃芪黃酮類及甲苷等，具有益氣補血、滋補排毒、抗輻射的功效，可以保護因輻射損傷的造血免疫系統(tǒng)，但具體機制尚未明晰。

轉錄因子NF-κB為同源或異源亞基形成的二聚體，可與核內DNA上的κB序列或胞質中IκB家族成員結合。細胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB與IκB結合成三聚體存在胞質中；當細胞受到如細胞因子、內毒素、病毒、活性氧自由基、鈣離子載體、紫外線及射線等信號刺激時，IκB的亞單位發(fā)生磷酸化激活，泛素化后被蛋白水解酶降解，釋放出的NF-κB發(fā)生核易位，特異性結合到基因上的κB位點，進而調控機體的免疫炎癥反應、細胞增殖與凋亡功能〔1〕。NF-κB可通過對其下游基因如bcl-2、bax及CyclinD1的轉錄調控來實現(xiàn)對細胞的增殖分化、凋亡與細胞周期的控制〔2，3〕。本研究過程中發(fā)現(xiàn)激活NF-κB信號既能誘導抗凋亡基因的表達，也能誘導促凋亡基因的表達，抗凋亡還是促凋亡取決于激活信號的差異和所在細胞的類型〔4〕。

骨髓內細胞極易受到輻射損傷，導致人體造血免疫功能障礙。射線可傷及骨髓內重要的造血細胞和骨髓基質細胞，啟動這些細胞的凋亡過程。NF-κB的激活是細胞凋亡通路的始動因素，而Bcl-2家族成員比例關系是調控細胞凋亡的關鍵因素，特別是bcl-2/bax比值是決定細胞生死的“平衡砝碼”。bax和bcl-2以同源或異源二聚體的形式來調節(jié)細胞凋亡過程：當bax-bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；bax-bcl-2形成異源二聚體時則抑制細胞凋亡〔5〕。

在輻射損傷后，MSC和骨髓細胞凋亡過程均由NF-κB信號分子活化啟動。本研究發(fā)現(xiàn)，輻射可激活體內外細胞NF-κB信號分子，啟動細胞的凋亡程序，當歸補血湯以其多藥效部位多作用靶點的特點，通過對參與細胞凋亡的NF-κB-bcl-2-bax信號通路，發(fā)揮其抗輻射損傷的作用，減少骨髓內細胞凋亡數(shù)，保護了機體的造血免疫器官。但實驗中出現(xiàn)了離體與在體間同一指標的變化差異，這可能與動物體內參與細胞凋亡的環(huán)境更為復雜有關，具體機制還有待進一步研究。

4參考文獻

1Gloire G，Piette J.Redox regulation of nuclear post-translational modifications during NF-κB activation〔J〕.Antioxid Redox Signal,2009；11(9)：2209-22.

2於亮亮，于皆平，羅和生.核因子-κB與細胞凋亡關系的研究進展〔J〕.世界華人消化雜志.2003；11(10)：1628-31.

3Ichikawa H，Takada Y，Murakami A，etal.Identification of a novel blocker of IκBα kinase that enhances cellular apoptosis and inhibits cellular invasion through suppression of NF-κB-regulated gene products〔J〕.J Immunol，2005；174(11)：7383-92.

4Agnieszka Siomek.NF-κB signaling pathway and free radical impact〔J〕.actabp.pl.2012；59(3)：323-31.

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〔2014-09-29修回〕

(編輯郭菁/徐杰)