蝙蝠TRAIL基因的克隆·表達及生物學功能分析

蝙蝠TRAIL基因的克隆·表達及生物學功能分析

裴麗麗1，2，侯歡歡1，盧 佳1，閆偉莉1，任文華1*

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046；2.南京醫科大學康達學院，江蘇連云港 222000)

摘要[目的]克隆蝙蝠TRAIL基因，構建蝙蝠可溶性TRAIL原核表達栽體，研究其對腫瘤細胞凋亡的影響。[方法]通過RT-PCR技術克隆蝙蝠TRAIL的全長cDNA序列，實時熒光定量PCR鑒定其組織分布，將其可溶性片段與表達載體pET43.1a連接，并在大腸桿菌BL21中高效表達和純化，通過western blotting證實。體外，通過MTT、TrypanBlue和流式細胞術檢測純化的可溶性TRAIL蛋白能否誘導腫瘤細胞的凋亡。[結果]成功克隆蝙蝠TRAIL基因，構建了重組表達載體，獲得可溶性TRAIL蛋白。體外試驗證明，可溶性蝙蝠TRAIL蛋白能夠誘導Jurkat細胞和HeLa細胞的凋亡。 [結論]可溶性蝙蝠TRAIL蛋白可誘導腫瘤細胞凋亡，該研究為蝙蝠免疫系統的研究奠定了基礎。

關鍵詞TRAIL；蝙蝠；熒光實時定量PCR；細胞凋亡

中圖分類號S188

基金項目國家自然科學

作者簡介裴麗麗(1987- )，女，山東臨沂人，助教，碩士，從事生物大分子活性物質研究。*

收稿日期2015-06-09

The Cloning, Expression and Biological Function of the Bat TRAIL Gene

PEI Li-li1,2, HOU Huan-huan1, LU Jia1, REN Wen-hua1*et al(1. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210046; 2. Kangda College of Nanjing Medical University, Lianyungang, Jiangsu 222000)

Abstract[Objective] To clone gene of the bat TRAIL and construct its soluble prokaryotie expression vector, and investigate its effect on tumor cell apoptosis. [Method] The full-length cDNA of TRAIL from the bat was cloned using RT-PCR techniques. Using real-time PCR to identify its tissue distribution, and its soluble TRAIL gene was linked with pET43.1a, efficiently expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and confirmed by Western blot analysis. In vitro, the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide (MTT) assay, TrypanBlue and Flow Cytometry analysis the purified soluble TRAIL could induce the apoptosis of tumor cells or not. [Result] The bTRAIL was successfully constructed and obtained a soluble bTRAIL protein. In vitro, the soluble bTRAIL could induce the apoptosis of Jurkat and HeLa cells. [Conclusion] The purified soluble bTRAIL protein can induce the apoptosis of the tumor cells. These results about bTRAIL gene would provide a basis for understanding the characteristics of the immune system of the bat.

Key wordsTRAIL;Pipistrellusjavanicus; Real-time PCR; Apoptosis

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子TNF超家族成員之一，通過2個不同的受體(TRAIL-R1，TRAIL-R2)，啟動不同的細胞效應，包括細胞的存活、活化、增殖、分化和細胞死亡[1-2]。它還可以在感染部位和有害的全身效應部位導致局部組織損傷[3]。在哺乳動物中，腫瘤壞死因子超家族成員主要包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、Fas配體(CD95配體)和腫瘤壞死因子(TNF)相關的凋亡誘導配體(Apo2L/TRAIL)[4-6]。TRIAL廣泛表達于許多組織中，包括外周血淋巴細胞、脾、前列腺、卵巢、小腸、大腸、胎盤、肺、肝和腎等，但在正常人腦組織、肝細胞和睪丸組織中未見表達。TRAIL能夠誘導腫瘤細胞、轉化細胞和病毒感染細胞等凋亡，而對正常組織無影響。表明TRAIL具有潛在的癌癥治療作用[7-8]。

關于蝙蝠和病毒的大多數知識都是由狂犬病病毒的研究獲得的[9]。然而，近年來，在醫學上，人類和獸類的許多新病毒已被發現寄生在蝙蝠中。目前，已經有超過100個病毒被檢測到寄生于蝙蝠。這些病毒在人類和其他物種均能引起疾病，但在自然或試驗感染蝙蝠后不會引起蝙蝠產生疾病[10-12]。說明蝙蝠可能具有自己獨特的免疫機制。目前，關于蝙蝠的研究主要集中在生態和生理方面，而關于蝙蝠免疫系統的研究很少[13-14]。筆者克隆的蝙蝠TRAIL基因是第一個被克隆的翼手目哺乳動物TRAIL基因，TRAIL基因的克隆、表達及功能研究有助于探索翼手目哺乳動物的免疫機制，為闡明蝙蝠免疫系統的特點提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物、細胞和宿主菌。蝙蝠是從南京師范大學生命科學學院動物所楊光教授實驗室獲得。大腸桿菌E.coli、Top10、BL21和pET43.1a由南京師范大學分子生物學實驗室保存；pMD19-T載體購于TaKaRa公司。

1.1.2試劑。動物組織RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)；PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成試劑盒、pMD19-T載體試劑盒、TaqDNA聚合酶、感受態細胞制備試劑盒、蛋白Marker、熒光定量PCR試劑盒、rTaq酶、限制性內切酶等均購自TaKaRa公司；鼠His6一抗，辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG購自TIANGEN公司；FITC標記的羊抗鼠IgG抗體(R&D Systems Inc.，USA)；所有引物合成及測序由上海英俊公司完成。

1.2方法

1.2.1蝙蝠脾臟總RNA的提取。利用動物組織RNA提取試劑盒，按照說明書操作，提取蝙蝠脾臟細胞的總RNA。

1.2.2蝙蝠TRAIL(bTRAIL)基因的克隆。通過序列比對分析已知的人、狗、馬和鼠TRAIL cDNA序列，設計簡并引物：正義引物bTRAIL F1：5′-ATAATGGCCCCAGAGAAGTCCAG-3′；反義引物bTRAIL F2：5′-CTAGCCAATTAAAAAGGCCCCAA-3′。 用上述引物進行RT-PCR。擴增參數：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃延伸30 s，72 ℃退火1 min，35個循環；72 ℃延伸7 min。進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。按Axygene公司的DNA膠回收試劑盒操作進行割膠回收約843 bp的DNA片段。用clastalW軟件對蝙蝠TRAIL序列和其他已知物種TRAIL序列進行序列比對。

1.2.3Real-time qPCR檢測TRAIL的組織分布。解剖蝙蝠，提取蝙蝠脾、心、肝、腎、肺、腸等組織的總RNA，用Primer 3 Input 軟件設計蝙蝠TRAIL和內參GAPDH引物如下：bTRAIL引物：btTRAILF1：5′- CCCTGCTGGCAAGTAAAGTG-3′；btTRAILF2：5′- CATGCCCTGAGTTTTCCCTG-3′。GAPDH引物：btGAPDH1：5′- GAGCTGAATGGGAAGCTCAC-3′；btGAPDH2：5′- GGAGGAGTGGGTGTCACTGT-3′。Real-time PCR反應程序：94 ℃ 5 min；40個循環(94 ℃ 15 s；62 ℃ 20 s；72 ℃ 15 s)。分別取3 μl PCR擴增產物，以2﹪的瓊脂糖凝膠檢測PCR產物是否為單一特異性條帶。

1.2.4融合表達載體pET43.1a-bsTRAIL的構建。據bTRAIL的胞外可溶片段設計一對含有pET43.1a酶切位點的基因特異性引物，擴增可溶性蝙蝠TRAIL片段(命名為bsTRAIL)，引物如下：bsTRAILF1：CCGGAATTCACCAGTGAGATGCAGCAGATGCA(EocRI site)；bsTRAILF2：CCGCTCGAGGCCAATTAAAAAGGCCCCAA(XhoI site)。PCR反應程序：94 ℃ 5 min，35循環(94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)，72 ℃ 7 min。純化回收PCR產物。EcoRI、XhoI雙酶切PCR產物與pET43.1a載體進行連接，構建pET43.1a-bsTRAIL表達載體。

1.2.5空載體pET43.1a標簽蛋白及重組蛋白的體外表達及鑒定。 首先分別將pET43.1a標簽(即Nus-His標簽蛋白)及測序正確的連接產物轉化入大腸桿菌BL21(DE3)，分別選取含pET43.1a標簽及重組體的表達菌株，置于LB培養基中(加入Amp+)，37 ℃，220 r/min培養，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，16 ℃，100 r/min振蕩培養24 h，分別誘導pET43.1a標簽蛋白及pET43.1a-bsTRAIL蛋白的表達。超聲破碎分離上清和沉淀，用鎳柱親和層析法分別獲得pET43.1a標簽蛋白及可溶性的pET43.1a-bsTRAIL蛋白，用SDS-PAGE跑膠鑒定，然后用1× PBS(pH8.0)對目的蛋白液進行透析。經western blotting鑒定純化的目的蛋白。將pET43.1a標簽蛋白及可溶性的pET43.1a-bsTRAIL蛋白的濃度(經測定獲得pET43.1a標簽蛋白濃度為1.233 mg/ml；獲得pET43.1a-bsTRAIL蛋白濃度為1.015 mg/ml)按以下公式換算成μmol/L=目的蛋白濃度 / 目的蛋白的分子量(pET43.1a標簽蛋白的分子量為66 kD；pET43.1a-bsTRAIL蛋白的分子量為97 kD)。

1.2.6pET43.1a-bsTRAIL蛋白生物活性測定。采用MTT法、細胞形態學觀察法、臺盼藍染色法及流式細胞術對已獲得的純化重組pET43.1a-bsTRAIL(命名為重組bsTRAIL)蛋白進行生物學活性檢測，并以pET43.1a蛋白作為對照。

2結果與分析

2.1bTRAIL的組織特異性分布用實時熒光定量PCR以GAPDH作為內參[15]分析bTRAIL的mRNA在不同組織中的相對表達量。SYBR Green實時熒光定量PCR分析表明bTRAIL的mRNA在心、肝、脾、肺、腎、小腸均有表達。但mRNA水平在不同組織中表達有差異(圖2)。其中在脾臟中mRNA表達量最高，其次是肝臟、腎臟、小腸、心臟，表達量最低的是肺。這表明蝙蝠TRAIL在免疫系統中起重要作用。

2.2pET43.1a-bsTRAIL蛋白的表達和純化為檢測重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白的生物學活性，重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白表達于大腸桿菌BL21(DE3)。經SDS-PAGE檢測(圖2)顯示，在約97 kD處為目的蛋白，經IPTG誘導24 h達到最大表達量。經Ni2+-NTA柱純化后，收集的蛋白經SDS-PAGE分析，以抗His標簽為標記的western blotting鑒定顯示，純化后的pET43.1a標簽蛋白及pET43.1a-bsTRAIL蛋白能與抗鼠His單抗發生特異性反應。經測定獲得pET43.1a標簽蛋白濃度為1.233 mg/ml；pET43.1a-bsTRAIL蛋白濃度為1.015 mg/ml。

2.3MTT法檢測重組bsTRAILMTT法測定重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白對Jurkat與HeLa腫瘤細胞的促凋亡作用。由圖3可知，在不同濃度下，重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白表現出抑制細胞增殖的作用，這種作用呈劑量依賴性，pET43.1a蛋白作為陰性對照。

2.4Jurkat和HeLa細胞的形態觀察和臺盼藍染色用4和6 μmol/L重組pET43.1a-bsTRAIL蛋白分別對Jurkat和HeLa細胞處理24、48 h后，在光學顯微鏡下觀察pET43.1a-bsTRAIL蛋白對Jurkat和HeLa細胞作用并進行拍照以及經臺盼藍染色后拍攝的照片(圖4)。由圖4可知，隨著時間的延長以及濃度的增加，細胞發生明顯的破裂和死亡。

2.5流式細胞儀檢測細胞的凋亡pET43.1a標簽蛋白與重組bsTRAIL蛋白對Jurkat腫瘤細胞作用36 h后，進行流式細胞儀檢測，結果見圖5。由圖5可知，4 μmol/L的pET43.1a標簽蛋白對Jurkat細胞作用后，在凋亡區FITC(+)/PI(一)檢測到少量細胞(0.6%)；4 μmol/L的重組bsTRAIL對Jurkat細胞作用后，在早起凋亡區FITC(+)/PI(一)檢測到較多細胞(29.98%)，在晚期凋亡區FITC(+)/PI(+)檢測到較少細胞(11.80%)；6 μmol/L的重組bsTRAIL對Jurkat細胞作用后，在晚期凋亡區FITC(+)/PI(+)檢測到較多的細胞(83.41%)。

3結論與討論

該試驗成功從蝙蝠脾臟中克隆得到腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)的cDNA序列，據知，目前這是通過分子克隆從翼手目哺乳動物中得到的第一個TRAIL基因。蝙蝠TRAIL(bTRAIL)CDS序列大小為843 bp，編碼280個氨基酸，GenBank登錄號為KF151168。預測蛋白的分子量為32.28 kD，等電點為8.11。和其他TRAIL一樣，蝙蝠TRAIL具有典型的跨膜區和TNF結構域，具有N端非保守區，而C端不同物種之間具有較大的保守性。人TRAIL(hTRAIL)蛋白的Cys230通過形成分子間二硫鍵誘導凋亡，是TRAIL發揮重要功能所必須的，而bTRAIL也具有Cys230。bTRAIL蛋白也含有一個預測的糖基化位點和一個保守的半胱氨酸殘基。在氨基酸水平上，用CLUSTAL軟件分析，顯示蝙蝠TRAIL和馬、人、狗和牛之間的序列同源性為68%、67%、68%和63%。這表明，在哺乳動物中，TRAIL的氨基酸序列是比較保守的，且胞外區比胞內區和跨膜區更保守。實時熒光定量PCR顯示，TRAIL在蝙蝠脾臟中的表達量最高，這與在人中TRAIL的分布一致。研究表明[16]，人的不可溶性TRAIL蛋白(sTRAIL)在100 ng/ml(相當于3 μmol/L的sTRAIL)處理Jurkat 和 HeLa細胞后，細胞死亡率為43%和45%，明顯大于蝙蝠可溶性TRAIL蛋白對Jurkat 和HeLa細胞的作用。此差異，可能是因為蝙蝠可溶性TRAIL基因和人的sTRAIL對人TRAIL受體具有不同的結合親和力。

為了研究重組bsTRAIL的活性，將其構建入pET43.1a表達載體。研究表明，人sTRAIL能夠誘導腫瘤細胞的凋亡，因此預測重組bsTRAIL也能誘導人腫瘤細胞凋亡，因此采用人Jurkat和Hela細胞來鑒定重組bsTRAIL的活性。首先采用MTT法檢測其對Jurkat和Hela細胞劑量依賴性的細胞毒理作用，結果表明重組bsTRAIL能以劑量依賴性的方式抑制細胞增殖。此外，重組bsTRAIL處理后，Jurkat和HeLa細胞的形態學觀察以及臺盼藍染色后的形態學觀察表明重組bsTRAIL蛋白可以以劑量依賴性的方式誘導Jurkat和HeLa細胞凋亡。為進一步驗證重組bsTRAIL的細胞毒理效用，采用流式細胞術驗證了重組bsTRAIL能夠誘導Jurkat和HeLa細胞的凋亡。由以上結果可知，重組bsTRAIL可誘導Jurkat細胞和HeLa細胞的凋亡。但是否重組的bsTRAIL可誘發其他人類腫瘤細胞株的凋亡還有待進一步研究。

綜上所述，該試驗首次從翼手目哺乳動物中克隆了蝙蝠TRAIL基因，并得到其活性蛋白，結果表明重組bsTRAIL能夠誘導Jurkat和Hela細胞的凋亡，這表明由于在進化上的保守性，不同物種的TRAIL蛋白之間存在交叉活性。該試驗不僅有利于蝙蝠的保護工作，也為翼手目哺乳動物的生物學功能研究鑒定了基礎。

參考文獻

[1] GOETZ F W，PLANAS J V，MACKENZIE S.Tumor necrosis factors[J].Developmental & Comparative Immunology，2004，28(5)：487-497.

[2] WARE C F.Protein therapeutics targeted at the TNF superfamily[J].Advances in Pharmacology(San Diego，Calif.)，2012，66：51-80.

[3] WATERS J P，POBER J S，BRADLEY J R.Tumour necrosis factor in infectious disease[J].The Journal of Pathology，2013，230(2)：132-147.

[4] GRUSS H J，DOWER S K.The TNF ligand superfamily and its relevance for human diseases[J].Cytokines and Molecular Therapy，1995，1(2)：75-105.

3.抓緊技改，強身健體，渡過難關。面對低迷經濟，企業可主動出擊，進行技術改造，為參與市場競爭創造更多有利條件。

[5] PITTI R M，MARSTERS S A，RUPPERT S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family[J].Journal of Biological Chemistry，1996，271(22)：12687-12690.

[6] WARE C F.TNF superfamily 2008[J].Cytokine & Growth Factor Reviews，2008，19(3/4)：183.

[7] FOX N L，HUMPHREYS R，LUSTER T A，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)receptor-1 and receptor-2 agonists for cancer therapy[J].Expert Opinion on Biological Therapy，2010，10(1)：1-18.

[8] GERSPACH J，PFIZENMAIER K，WAJANT H.Therapeutic targeting of CD95 and the TRAIL death receptors[J].Recent Patents on Anti-cancer Drug Discovery，2011，6(3)：294-310.

[9] CALISHER C H，CHILDS J E，FIELD H E，et al.Bats：Important reservoir hosts of emerging viruses[J].Clinical Microbiology Reviews，2006，19(3)：531-545.

[10] WONG S，LAU S，WOO P，et al.Bats as a continuing source of emerging infections in humans[J].Reviews in Medical Virology，2007，17(2)：67-91.

[11] MEERBURG B G，SINGLETON G R，KIJLSTRA A.Rodent-borne diseases and their risks for public health[J].Critical Reviews in Microbiology，2009，35(3)：221-270.

[12] CHUA K B，CRAMERI G，HYATT A，et al.A previously unknown reovirus of bat origin is associated with an acute respiratory disease in humans[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104(27)：11424-11429.

[13] WANG L F，SHI Z，ZHANG S，et al.Review of bats and SARS[J].Emerging Infectious Diseases，2006，12(12)：1834.

[14] YOU F，REN W，HOU H，et al.Molecular cloning，expression，bioinformatics analysis and bioactivity characterization of TNF13B(BAFF)gene in bat (VespertiliosuperansThomas)[J].International Immunopharmacology，2012，12(2)：433-440.

[15] SU J G，ZHANGA R F，DONG J，et al.Evaluation of internal control genes for qRT-PCR normalization in tissues and cell culture for antiviral studies of grass carp(Ctenopharyngodon idella)[J].Fish & Shellfish Immunology，2011，30：830-835.

[16] LI J F，AI H X，ZHANG J，et al.Molecular cloning，functional characterization and phylogenetic analysis of TRAIL in Japanese pufferfish Takifugu rubripes[J].Journal of Fish Biology，2011，79(3)：747-760.