高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶

高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶

許秀琴， 楊 挺， 趙 健， 章 豪， 吳銀良， 王立君， 朱 勇

(寧波市農業科學研究院，浙江寧波 315040)

摘要研究建立了高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的方法。樣品中的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇提取，過WCX柱，LC-MS/MS進行分析。分析時采用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以0.10%甲酸水-甲醇作為流動相進行梯度洗脫，電噴霧正電子(ESI+)模式電離，多反應監測(MRM)模式檢測，外標法進行定量。結果表明，鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶標準溶液在1.0～50.0 μg/L范圍內，峰面積與含量呈線性相關。鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的檢出限均為0.20 μg/kg，樣品中添標回收率在85%～100%，相對標準偏差(RSD)小于10%。

關鍵詞高效液相色譜-串聯質譜；鹽酸可樂定；鹽酸賽賡啶；豬肉

中圖分類號S851.34+7;TS251.7

基金項目寧波市農科教項目(2014NK36)。

作者簡介許秀琴(1980- )，女，江蘇東海人，工程師，博士，從事食品檢測研究。

收稿日期2015-06-22

Determination of Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride in Swine Tissue by Ultra Performance Liquid Chromatography -Tandem Mass Spectrometry

XU Xiu-qin,YANG Ting,ZHAO Jian et al (Ningbo Academy of Agricultural Sciences,Ningbo,Zhejiang 315040)

AbstractA simple and sensitive LC-MS/MS method for the determination of Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride in swine tissue was developed.Samples were extracted with acidification of methanol by 0.1 mol/L HCl,through WCX column and analyzed by LC/MS-MS on a Waters Acquity BEH C18 column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) with 0.10% formic acid in water/methanol as the mobile phase by means of gradient elution.Detection was carried out with an electrospray ionisation (ESI) probe and operated in the positive ion mode.Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride was quantified by the external standard method.There was a good linearity in the range of concentrations between 1.0 and 50.0 μg/L.The limits of detection for Clonidine Hydrochloride and Cyproheptadine Hydrochloride were both 0.20 μg/kg.The recoveries from spiked samples were in the range of 85% to 100% and the relative standard deviations were lower than 10%.

Key words Ultra Performance Liquid Chromatography -Tandem Mass Spectrometry; Clonidine hydrochloride; Cyproheptadine hydrochloride; Swine tissue

鹽酸可樂定(Clonidine Hydrochloride,分子式為C9H9Cl2N3·HCl)和鹽酸賽庚啶(Cyproheptadine hydrochloride,分子式為C21H21N·HCl)分別作為人類使用的抗高血壓藥物和抗組胺藥[1]，分子結構式如圖1、圖2所示。鹽酸可樂定主要用于治療高血壓、高血壓急癥、偏頭痛、絕經期潮熱、痛經以及戒絕阿片癮毒癥狀，常見的不良反應有口干、昏睡、頭暈、精神抑郁、便秘和鎮靜、性功能降低和夜尿多、瘙癢、惡心、嘔吐、失眠、蕁麻疹、血管神經性水腫和風疹、疲勞、直立性癥狀、緊張和焦躁、脫發、皮疹、厭食和全身不適、體重增加、頭痛、乏力、戒斷綜合征、短暫肝功能異常等。鹽酸賽庚啶主要用于治療蕁麻疹、濕疹、過敏性和接觸性皮炎、皮膚瘙癢、鼻炎、偏頭痛、支氣管哮喘等，主要不良反應有嗜睡、頭昏、乏力等。將可樂定添加于飼料中，可以促進豬的生長，并提高瘦肉率[2-3]，賽庚啶也有一定的刺激食欲的功能[4]。因此，國內有發現畜產品養殖者將這2種藥物添加于飼料中，這無疑會給人類的健康帶來危害。北京懷柔就發生過可樂定的中毒事件[5]，造成34人出現頭暈，昏迷并入院治療。農業部于2010年12月27日發布1519號公告，禁止在飼料和動物飲水中使用鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶。目前，對于鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的測定主要集中于醫藥領域[6-17]，陳其煌測定了豬尿和豬肝中的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶[1,18]；柯光明等測定了家兔血液中的可樂定含量[19]，曹瑩等[20-21]、李丹妮等[4]測定了飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶。對于豬肉中的可樂定及賽庚啶至今尚無人測定，筆者采用高效液相色譜-串聯質譜法測定了豬肉中的可樂定和賽庚啶含量，檢測限低準確度高，可以很好地用于豬肉樣品中可樂定和賽庚啶的測定。

1材料與方法

1.1材料UPLC-XEVO超高效液相色譜質譜儀，美國Waters 公司；SIGMA3K15離心機，北京博勵行有限公司；RT SPE全自動固相萃取儀，美國Caliper;Mili Q 超純水儀，美國Millipore 公司。

鹽酸可樂定標準品、鹽酸賽庚啶標準品，中國藥品生物制品檢定所。固相萃取柱：Oasis?WCX 500 mg,3 ml；CleanertSCX 500 mg,3 ml；CNWBOND HC-C18200 mg,3 ml；Oasis?MCX 500 mg,3 ml；甲醇和乙腈(色譜純)，美國默克公司；試驗用水為Mili Q超純水儀所制超純水；其他試劑均為分析純試劑。

1.2標準溶液的配制

1.2.1標準儲備液。稱取鹽酸可樂定、鹽酸賽庚啶標準品10.0 mg定容至100 ml甲醇中，質量濃度為100 mg/L，于-18 ℃保存，保質期為6個月。用甲醇稀釋為20.0 mg/L的中間液。

1.2.2標準工作液。用流動相(甲醇∶0.1%甲酸水=20∶80)稀釋標準中間液20.0 mg/L 的鹽酸可樂定、鹽酸賽庚啶分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的標準工作液，現配現用。

1.3儀器條件

1.3.1液相色譜條件。色譜柱Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)(梯度洗脫)；梯度洗脫程序：0～0.5 min，20% B；0.5～2.5 min，20%B～50%B，保持1 min；3.6 min，20%B保持1.4 min。流速:0.2 ml/min,柱溫箱溫度：25 ℃；進樣量10 μl。

1.3.2質譜條件。離子源為電噴霧離子源(ESI)；正離子方式檢測，采用多反應離子(MRM)監測，內標法定量。噴霧毛細管電壓1.5 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑氣溫度500 ℃，去溶劑氣流速為1 000 L/h,碰撞氣流速0.20 ml/min，放大倍數為600。數據應用軟件MassLynx version 4.1進行分析。

1.3.3標準溶液及樣品的測定。在上述方法下，標準溶液及加標樣品中鹽酸可樂定、鹽酸賽庚啶的峰形良好。標準溶液中鹽酸可樂定、鹽酸賽庚啶的色譜圖見圖3，豬肉中的加標樣品色譜圖見圖4，豬肉空白樣品于保留時間處無干擾，色譜圖見圖5。

1.4樣品前處理稱取豬肉樣品2 g,加入鹽酸可樂定、鹽酸賽庚啶標準溶液20 mg/L 25.0 μl。用10 ml 0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取，勻漿1 min,振蕩30 min,120 000 r/min離心5 min，倒出清液，再加入10 ml 0.01 mol/L HCl再按上述方法提取一次，合并2次提取液，混勻。取5 ml提取液準備過柱。取WCX柱，依次用6 ml甲醇，6 ml 0.01 mol/L HCl潤洗，5 ml提取液上樣。依次用純水，20%甲醇水清洗，抽干，用5 ml 1 mol/L乙酸甲醇洗脫,40 ℃水浴氮氣吹干，用1 ml 0.1%甲酸水+甲醇(80+20)定容，過0.25 μm濾膜。

2結果與分析

2.1樣品前處理過程的優化

2.1.1提取溶劑的選擇。根據鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的化學性質，選擇應用甲醇∶0.1 mol/L HCl=80∶20,甲醇∶水=1∶1，乙酸乙酯-異丙醇(6∶4，V/V)來提取豬肉中的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶。

結果表明，用0.1 mol/L HCl酸化甲醇提取，可獲得最高的回收率，最終采用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取豬肉中的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶。

2.1.2SPE柱的選擇。稱取豬肉樣品2 g,加入鹽酸可樂定、鹽酸賽庚啶標準溶液20 mg/L 25.0 μl。按照“1.4”方法進行提取,考察提取液在WCX、SCX、C18,MCX柱上的保留情況。過柱方法按照“1.4”方法進行。經UPLC-MS-MS測定后，結果顯示，豬肉樣品提取液中的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶在WCX柱上保留效果最好，加標回收率最高。故選擇WCX柱。

2.1.3洗脫液的選擇。根據鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的化學性質及相關文獻，選擇氨化甲醇、乙酸甲醇、含2%氨水的甲醇水(1∶1,V/V)溶液，作為洗脫液，考察其洗脫效果。加標樣品按照“1.4”方法操作，上機測試。結果顯示，應用乙酸甲醇洗脫，回收率最高。而后又選擇了1、2、5 mol/L的乙酸甲醇進行加標回收試驗，結果顯示，各種濃度的乙酸甲醇溶液均可獲得較好的回收率，2 mol/L的乙酸甲醇所獲得的回收率最高，故選擇2 mol/L的乙酸甲醇作為洗脫液。

2.2儀器條件的選擇用1 000 μg/L的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶溶液來確定合適的離子。離子源為電噴霧離子源(ESI)；經過優化流動相和質譜參數，發現鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶在正離子模式下的反應離子監測靈敏度顯著優于負離子模式，該試驗采用正離子掃描監測模式。在優化了碰撞條件后，獲得了最佳質譜條件：噴霧毛細管電壓1.5 kV，離子源溫度150 ℃，去溶劑氣溫度500 ℃，去溶劑氣流速為1 000 L/h,碰撞氣流速0.20 ml/min，放大倍數為600。優化好質譜條件后，開始優化流動相與液相色譜柱。選擇Acquity HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)柱和Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)柱比較鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶在這2種柱子上的保留效果。試驗發現，在相同的流動相和色譜條件下，鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶在Acquity HSS T3柱上的信號強度明顯低于在Acquity BEH C18柱，因此選擇Acquity BEH C18柱作為分析柱。在流動相優化方面，發現鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶在甲酸水-乙腈體系中的靈敏度低于在甲酸水-甲醇體系中的靈敏度，因此選擇0.1%甲酸水-甲醇體系作為流動相。

2.3標準曲線與線性范圍用流動相(甲醇∶0.1%甲酸水=20∶80)配制標準工作液1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L。經LC-MS-MS測定，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數，如圖6，圖7。結果顯示，在該濃度內，鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的線性范圍良好，回歸方程和相關系數分別為y=4 270.2x+18 352,R2=0.998 6;y=4 118.8 x+6 156.2,R2=0.997 8。

2.4靈敏度根據測定標準曲線所得的結果，配制相近濃度的陽性添加樣品，按照“1.4”進行操作，測定其實際信噪比。以信噪比S/N≥3為檢測限，以信噪比S/N≥10為定量限。試驗結果表明，豬肉樣品中鹽酸可樂定的檢出限為0.2 μg/L,定量限為0.6 μg/L；鹽酸賽庚啶的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.6 μg/kg。

2.5精密度和回收率稱取豬肉樣品2 g，制成1.0、2.0、4.0 μg/kg的添標樣品，按照“1.4”進行操作，每個添加水平重復3次，每次每個濃度5個添加樣品進行定量分析。結果表明，在豬肉樣品中，鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的批內和批間的精密度均小于10%，回收率均在85%～100%，如表1、表2。

表1　豬肉樣品中鹽酸可樂定的回收率和精密度測定結果

表2　豬肉樣品中鹽酸賽庚啶的回收率和精密度測定結果

3結論

該試驗制定了一種豬肉樣品中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的測定方法。利用0.1 mol/L HCl酸化的甲醇(VCH3OH /VHCl=80∶20)提取，WCX固相萃取小柱凈化，UPLC-MS-MS法測定。應用這種方法測定豬肉中的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶，簡便、快捷，檢出限低，回收率高，為豬肉中可樂定和賽庚啶的測定提供了可靠的技術手段。

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