樹莓中超氧化物歧化酶（SOD）提取及不同條件下酶活力探究

張媛婷，遲曉平，李婧萱，李劍華，李申巖

沈陽(yáng)師范大學(xué)

樹莓中超氧化物歧化酶（SOD）提取及不同條件下酶活力探究

張媛婷，遲曉平，李婧萱，李劍華，李申巖

沈陽(yáng)師范大學(xué)

由冷凍樹莓制得粗酶液，測(cè)樹莓中超氧化物歧化酶（SOD）的活力48.78U/g，其含量228.544μg/g鮮重。通過分別以新鮮的樹莓、解凍1h樹莓和加入濃度為10-6mol/L的抗壞血酸浸泡1min的樹莓果實(shí)來探究酶活力。結(jié)果表明：相對(duì)條件下，冷凍樹莓有最大的超氧化物歧化酶（SOD）活力。

樹莓；超氧化物歧化酶；提取；酶活力

引言：

樹莓超氧化物歧化酶（SOD）是一種含有金屬元素的活性蛋白酶存在于生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)自然存在超氧自由基清除因子。

樹莓產(chǎn)量較大，富含SOD和花青素等多種物質(zhì)，能發(fā)展成果汁、化妝品生產(chǎn)線。因SOD具有強(qiáng)氧化力、抗衰老作用，在化妝品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，但國(guó)際禁止在動(dòng)物的血液中提取，故從多種植物中SOD，本次實(shí)驗(yàn)將從樹莓果實(shí)中提取粗酶液并對(duì)SOD的活力進(jìn)行探究。

正文：

1 材料與方法

1.1 材料

基礎(chǔ)材料：丹東鳳城樹莓生產(chǎn)基地提供的樹莓果實(shí)

1.2 試劑與儀器：

蛋氨酸(Met)，氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)，核黃素，干燥的牛血清白蛋白，考馬斯亮藍(lán)，石英砂（SiO2），乙二胺四乙酸二鈉，甲硫氨酸：遼寧永強(qiáng)醫(yī)藥器械化玻有限公司試劑廠；藥品均為分析純。

WFJ7200型可見分光光度計(jì)，Himac cR21G高速冷凍離心機(jī)，Sartrius分析天平。

1.3 提取方法

1.3.1 溶液的配制

溶液濃度：蛋氨酸磷酸鈉緩沖液(蛋氨酸濃度2.6x10-2mol∕L，用0.1mol∕L磷酸鈉緩沖液配制)；磷酸鹽緩沖液0.05mol∕L(PH=7.8)；氮藍(lán)四唑溶液750μmol∕L；核黃素溶液20μmol∕L；甲硫氨酸溶液130mmol∕L；乙二胺四乙酸二鈉溶液100μmol∕L。

1.3.2 提取樹莓液

冷凍研缽和研杵10min，冷藏磷酸緩沖溶液50mL，精確稱取20g冷凍樹莓果實(shí)于研缽中，加入磷酸緩沖液15mL和少許石英砂（SiO2）充分研磨后裝入1.5mL離心管中，用高速冷凍離心機(jī)在12000r∕min，4℃條件下離心40min。離心后將上清液倒入量筒中，其中的沉淀重新在加入15mL磷酸緩沖溶液冷凍研缽中充分研磨，再裝入離心管中離心40min。同樣離心后將上清液倒入量筒中，合并兩次上清液，即得粗酶液總體積。

1.4 NBT光還原法測(cè)酶活力

1.4.1 酶活力測(cè)定

取8支試管編號(hào)1-8，分別加入甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、EDTANa2、核黃素、蒸餾水各1.00mL，依次加入緩沖液5.00、5.00、5.00、4.85、4.70、4.55、4.40、4.25 mL，粗酶液0.00、0.00、0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，混合均勻。標(biāo)號(hào)為1號(hào)為空白組吸光度值歸零，不光照，其余在兩個(gè)210W大燈泡下照射15min。第2～8組在560nm下測(cè)吸光度值。

D1——第2組與第3組吸光度值平均值

D2——第4組到第8組各自的吸光度值

以下式求得20g冷凍樹莓的總酶活力。

1.4.2 酶活力探究

按照1.3提取方法，分別用新鮮樹莓，解凍1h樹莓，浸泡在10-6mol∕L抗壞血酸溶液中1min的樹莓果實(shí)代替冷凍樹莓。得到各自粗酶液，以1.4.1測(cè)酶活力原理，得各自總酶活力來斷定何種材料具有最大的超氧化物歧化酶（SOD）活力。

1.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定——考馬斯亮藍(lán)法

1.5.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取己干燥的牛血清白蛋白0.01g溶解并定容100mL得標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，取6支試管編號(hào)1-6，分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5mL，依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白液0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，蒸餾水1.00、0.98、0.96、0.94、0.92、0.90 mL，以1號(hào)為空白組，在波長(zhǎng)595nm條件下測(cè)定吸光度值，繪制曲線。

1.5.2 測(cè)定酶液的SOD含量

另取2支試管，均吸取在50%抑制率下的粗酶液量即XmL，移入試管中，依次加入(1-X)ml蒸餾水，5mL的考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻后靜置2min，在OD595nm條件下，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號(hào)試管做空白，測(cè)吸光度值，并求兩組吸光度平均值，再通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線，得在X(mL)下SOD含量Y（μg）。根據(jù)下式可得總SOD含量。

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖一