不同程度間歇性低氧大鼠學習記憶及皮質和海馬區神經細胞凋亡的變化

不同程度間歇性低氧大鼠學習記憶及皮質和海馬區神經細胞凋亡的變化

趙雅寧王紅陽1李琳1馬素慧

(河北聯合大學康復醫學院，河北唐山063000)

摘要〔〕目的復制不同程度間歇性低氧動物模型，觀察神經細胞形態結構及神經細胞凋亡變化，探討阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)導致認知障礙的機制。方法60只雄性SD大鼠隨機分成對照組(n=20)、輕度間歇低氧組(n=20)、重度間歇低氧組(n=20)。對照組暴露于空氣中，間歇低氧組分別暴露于不同低氧條件下(100 ml/L和50 ml/L，暴露時間每天8 h，持續時間2、4、6、8 w)。Morris水迷宮檢測學習記憶功能，光鏡和電鏡觀察神經細胞超微結構，原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞。結果與對照組比較，隨低氧時間的延長，兩間歇性低氧組大鼠神經元結構損傷； TUNEL陽性細胞增多(P<0.05)；水迷宮檢測動物逃避潛伏期時間延長、穿臺次數減少(P<0.05)；上述變化在重度間歇性低氧組最為顯著(P<0.05)；輕度間歇性低氧組TUNEL陽性細胞6 w達高峰，組內各時間差異顯著(P<0.05)；重度間歇性低氧組TUNEL陽性細胞8 w達高峰，組內各時間差異顯著(P<0.05)。結論間歇性低氧可導致大鼠認知功能障礙，其機制與神經細胞凋亡有關，且認知損傷程度和神經細胞凋亡與間歇性低氧的時間和程度有關。

關鍵詞〔〕低氧；凋亡；認知障礙

中圖分類號〔〕R563.3〔

基金項目：河北省科技廳資助項目(No.09276103D-11)

通訊作者：王紅陽(1957-)，女，教授，主要從事呼吸病學研究。

1河北聯合大學附屬醫院

第一作者：趙雅寧(1974-)，女，副教授，博士，主要從事呼吸病學研究。

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS) 患者睡眠時反復出現不同程度的低氧血癥和(或)高碳酸血癥，最終引起全身多系統、多器官的漸進性損害。臨床資料顯示OSAHS可造成患者警覺、執行能力和運動協調方面的認知障礙〔1，2〕。皮質和海馬是腦內與認知和記憶等高級功能密切相關的重要部位，其結構的損傷可造成智力下降及認知行為紊亂。本研究中，我們在參考其他學者慢性間歇性缺氧模型基礎上，利用實時氧監測的反饋信號模擬臨床呼吸暫停事件的真實狀態，研究不同間歇性低氧狀態對腦組織形態變化、神經細胞凋亡特點以及認知功能的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑及儀器雄性SD大鼠60只〔北京維通利華公司，合格證SCXK(京)2002-003〕，體重310～350 g；TUNEL試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)。H-7650透射電鏡(日本日立公司)；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(中國醫學科學研究院藥物研究所)；測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(天津醫科大學總醫院呼吸科)；純氮(天津六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫科大學研制)。

1.2動物分組和模型制備60只雄性SD大鼠隨機分成對照組(n=20)、輕度間歇低氧組(暴露低氧條件100 ml/L，n=20)和重度間歇低氧組(暴露低氧條件50 ml/L，n=20)。間歇低氧組每天8：00 am～4：00 pm將實驗動物置于模型艙內，向艙內循環充入氮氣和空氣，每次循環2 min，連續給予氮氣30 s，分別維持艙內氧濃度最低至10%、7.5%和5%(100、75、50 ml/L)，隨后均復氧至氧濃度21%。對照組持續充入壓縮空氣。用數字測氧儀監測艙內氧濃度變化，使艙內氧濃度維持在各自的氧濃度內，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內。實驗結束將實驗動物取出，送入常規飼養箱內自由飲水與攝食，生活環境及飼養條件相同。各組每天實驗8 h,實驗持續時間為2、4、6和8 w。對照組暴露于正常空氣中；分別在實驗第2、4、6和8周進行Morris水迷宮測試和所設指標檢測。

1.3腦組織形態結構觀察各組各時間點4只動物，在規定時間點以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛經左心室灌注固定后取腦,后固定24 h，梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋，切片,片厚5 μm。切片經二甲苯脫蠟,梯度乙醇降至水，HE染色。每只鼠連續3張冠狀背側海馬切片，采用圖像分析儀(美國Bio-Rad公司)計數正常神經元，取均值。電鏡標本制備：動物常規麻醉，開胸、暴露心臟，混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸緩沖液)心臟灌流，斷頭取腦，取大腦海馬組織，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 組織塊，立即以40 ml/L戊二醛固定，0.1 mol/L 二甲砷酸緩沖液沖洗兩遍，再經40 ml/L四氧化鋨固定,緩沖液沖洗,逐級丙酮脫水,環氧樹脂浸透、包埋、超薄切片，醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(日立H-7650)80 kV下觀察腦組織超微結構并攝片。

1.4原位細胞凋亡檢測(TUNEL法)標本多聚甲醛固定，經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按TUNEL檢測試劑盒進行操作，DAB 顯色，蘇木精復染。陽性率的定量分析：每個標本取 4張切片，每張切片在海馬隨機選取 4 個視野，在 200 倍光鏡下應用目鏡網格測試系統，計數陽性細胞，取均值。

1.5學習和記憶功能檢測采用Morris水迷宮進行檢測。每只動物晨起訓練5次后分別在上午、下午各測試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間單位為(s)；及撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數，取檢測記錄的總均值。

1.6統計學方法應用SPSS17.0統計軟件對組間數據比較進行方差分析。

2結果

2.1病理結果光鏡：對照組皮質和海馬神經細胞形態基本結構正常，排列整齊致密，偶見變性壞死的神經元；輕中重度間歇性低氧組中，隨缺氧時間延長神經元結構出現明顯損傷改變，表現為細胞變性水腫和死亡形態的神經細胞。與對照組比較，兩組間歇低氧組皮質和海馬區存活神經元密度隨缺氧時間延長明顯減少(P<0.05)；輕度低氧組存活神經元密度6 w最低，而重度低氧組8 w最低(P<0.05，表1)。電鏡：對照組神經元細胞核規則，核仁清晰，核質均勻散在，核膜光滑，邊緣清晰，神經元內細胞器,包括高爾基體、粗面內質網、多聚核糖體、線粒體、溶酶體等豐富，結構正常；突觸結構完整清晰。間歇低氧組隨低氧時間延長和低氧程度加重神經細胞超微結構變化出現核仁消失，胞質中的電子密度減低區增多，胞質空泡化，細胞器減少、突觸小泡模糊、數量減少甚至不能辨認。見圖1。

2.2海馬區神經細胞凋亡變化TUNEL陽性產物主要位于細胞核。對照組大鼠海馬區只有極少數陽性細胞，間歇性低氧組中陽性細胞呈集中分布，主要分布皮質和海馬區，尤其是前額葉皮質、海馬CA1區、齒狀回、杏仁核區域最為突出。與對照組比較，輕度和重度間歇性低氧組中皮質和海馬區TUNEL陽性細胞在各時間點均不同程度增加；輕度間歇性低氧TUNEL陽性細胞數量6 w達高峰，8 w表達減少；重度間歇低氧組TUNEL陽性細胞數量8 w達高峰，組內各時間比較差異顯著(P<0.05)，見表2，圖2。

2.3學習記憶功能評估與對照組比較，輕度和重度間歇性低氧組大鼠逃避潛伏期時間均延長、穿越原平臺位置的次數均減少；與輕度組比較，重度間歇性低氧組逃避潛伏期時間延長、穿越原平臺位置的次數減少(P<0.05)，見表3。

表1　皮質區和海馬區存活神經元密度比較 ± s， n=20)

與對照組比較：1)P<0.05；與本組內前一時點比較：2)P<0.05，表2同

圖1　各組大鼠6 w海馬區神經元和突觸結構變化(電鏡，×20 000)

組別皮質區2w 4w 6w 8w海馬區2w 4w 6w 8w對照組1.98±0.362.14±0.322.08±0.502.00±0.482.40±0.422.42±0.382.58±0.572.74±0.56輕度組3.12±0.581)2)4.89±0.681)2)8.96±1.451)2)5.96±0.781)2)3.40±0.491)2)4.39±0.731)2)9.54±1.361)2)6.10±0.721)2)重度組7.10±0.841)9.60±0.921)2)13.96±3.001)2)18.70±2.561)2)6.60±0.691)9.68±0.791)2)15.94±2.921)2)19.82±2.611)2)

表3　各組大鼠逃避潛伏期及穿臺次數的比較 ± s， n=20)

與對照組比較：1)P<0.05；與輕度組比較：2)P<0.05

圖2　重度間歇低氧6 w組大鼠皮質和海馬區 凋亡神經細胞(×400)

3討論

學習是人和動物依賴于經驗來改變自身行為以適應環境的神經活動過程，而記憶是將學習到的信息貯存和“讀出”的神經活動過程，兩者相互聯系。水迷宮測試中逃避潛伏期反映大鼠通過對空間標志物的比較和評價來尋找平臺位置的能力，即獲取有效學習能力，而檢測穿越原平臺位置次數反映記憶的保持能力，結果顯示隨缺氧時間的延長和缺氧程度越重，動物學習和記憶損傷越嚴重，這不但與低壓損害學習記憶具有“高度依賴形式”的報道相一致，同時與臨床實際相符合〔3〕。皮質和海馬是腦內與學習和記憶密切相關的部位。動物實驗表明損毀雙側海馬可大大妨礙動物視覺分辨學習，使大鼠Y宮分辨學習和防御條件反應的保持遭到嚴重的破壞〔4〕；與生活環境簡單大鼠比較，生活在復雜環境的動物學習記憶活動增多，其大腦皮層發達，突觸聯系增多〔5〕。臨床上，神經影像學顯示OSAHS患者大腦的多個部位和功能區受損如大腦皮質灰質丟失，海馬區在內的腦實質萎縮等〔6〕。本研究提示間歇性低氧可直接造成海馬區神經細胞結構損傷，且與低氧程度相關，再次證明低氧造成的認知障礙與皮質和海馬區組織結構的損傷有關。

細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。但病理狀態下，神經細胞凋亡異常增多是多種中樞神經系統疾病諸如腦卒中、老年癡呆和帕金森等疾病的重要病理機制〔7，8〕。我們前期的研究顯示不同的干預方法抑制神經細胞凋亡可明顯改善腦損傷后的神經功能障礙〔9，10〕。本研究提示間歇性低氧造成的神經細胞凋亡與低氧程度有關，輕度間歇性低氧組凋亡細胞數量與低氧時間的延長不是完全平行的，凋亡細胞數量在6 w達高峰，而重度間歇性低氧組神經細胞凋亡數量呈高度時間依賴式增多，8 w達高峰，分析其原因可能是輕度慢性缺氧誘導了低氧耐受，啟動了大腦內部某些內源性保護機制，而重度低氧直接導致了神經損傷。在分布區域方面，凋亡神經細胞呈集中分布，主要分布皮質和海馬區，尤其是前額葉皮質、海馬CA1區、齒狀回、杏仁核區域最為突出；此與腦缺血主要造成海馬CA1區及紋狀體區神經元凋亡不同〔11〕。有學者〔12〕認為間斷低氧類似于缺血再灌注，可造成神經元的丟失，且缺氧較缺血對腦細胞的誘導凋亡作用更加明顯。本研究中間歇性低氧的特征反復發生的低氧/再復氧為特征，氧化應激是其神經損傷的關鍵因素，這可能是低氧與缺血造成神經細胞凋亡不同的原因之一。

總之，本實驗證實了不同程度間歇性低氧導致皮質和海馬區腦組織形態結構損傷，神經元丟失，這在一定程度上解釋了OSAHS患者認知功能損害的原因。

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〔2012-11-13修回〕

(編輯曹夢園)