白樺脂酸聯合硼替佐米誘導U266細胞凋亡及其機制研究

·基礎研究·

白樺脂酸聯合硼替佐米誘導U266細胞凋亡及其機制研究*

網絡出版時間：2015-09-11網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2242.006.html

孫嘉1**， 馬丹2， 王萍2， 方琴3***

(1.貴州醫科大學， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學附院 血液科， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫科大學附屬白云醫院 藥劑科， 貴州 貴陽550014)

[摘要]目的： 探討白樺脂酸(BA)聯合硼替佐米誘導多發性骨髓瘤(MM)U266細胞凋亡及其機制。方法：用不同濃度的BA(20、40、60及80 mg/L)、硼替佐米(10、80及320 nmol/L)、40 mg/L BA分別聯合10、80及320 nmol/L硼替佐米(聯合1～3組)處理U266細胞，MTT法檢測上述各組U266細胞增殖抑制率；Real-time PCR和蛋白免疫印跡法(Western blot)分別檢測40 mg/L BA、80 nmol/L硼替佐米及40 mg/L BA聯合80 nmol/L硼替佐米(聯合4組)的U266細胞Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax的 mRNA和蛋白表達水平。結果：聯合1～3組對U266細胞增殖抑制率顯著高于BA組和硼替佐米組(P<0.05)；與硼替佐米組和BA組相比，聯合4組U266細胞的cyto-C,Bax mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，而Survivin、Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。結論：BA聯合硼替佐米可以促進MM腫瘤細胞凋亡，機制可能與下調Survivin、Bcl-2表達，上調Cyto-c、Bax表達有關。

[關鍵詞]白樺脂酸； 硼替佐米； U266細胞； 凋亡； 基因表達

[基金項目]*國家自然科學基金(No:81360501)**貴州醫科大學2012級碩士研究生***通信作者 E-mail:47420755@qq.com

[中圖分類號]R733.3； R34-33

Research on Betulinic Acid Combined with Bortezomib

Inducing U266 Cell Apoptosis and Its mechanism

SUN Jia1, MA Dan2, WANG Ping2, FANG QIN3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofHematology,Affiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofPharmacy,

BaiyunHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550014,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate betulinic acid combined with bortezomib inducing apoptosis of multiple myeloma (MM) U266 cells and its mechanism. Method:U266 cells were treated with betulinic acid(20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg/L, 80 mg/L), bortezomib (10 nmol/L, 80 nmol/L,320 nmol/L), BA(40 mg/L) combined with 10 nmol/L, 80 nmol/L, 320 nmol/L bortezomib (combination 1～3 groups). The proliferation inhibition rate of U266 cells was detected by MTT assay; Real-time PCR and Western blot were applied to detect mRNA and protein expression levels of Survivin, Cyto C, of BCL-2 and Bax in 40 mg/L BA group, 80 nmol/L bortezomib group and 40 mg/L BA combined with 80 nmol/L bortezomib group. Results: Proliferation inhibition rate of U266 cells in combination 1～3 groups was significantly higher than that in BA group and bortezomib group (P<0.05); compared with BA group and bortezomib group, mRNA and protein expression levels of Cyto C，Bax in the combination 4 group were remarkably increased (P<0.05), the Survivin, Bcl-2 mRNA and protein expression levels were significantly decreased (P<0.05). Conclusions: The betulinic acid combined with bortezomib is proved to induce apoptosis of MM cells and its mechanism may be associated with the down-regulation of Survivin, BCL-2 and up-regulation of Cyto-c, Bax expression levels.

[Key words] betulinic acid; borezomib; U266 cells; apoptosis; gene expression

多發性骨髓瘤(MM)是多發于中老年的惡性血液腫瘤之一，是發生在B淋巴細胞終末階段的惡性漿細胞病變[1-3]。近年來，臨床上多采用以硼替佐米或來那度胺為基礎的化療方案，聯合環磷酰胺、阿霉素等藥物進行誘導化療，但因MM是不可治愈性疾病，需長期治療[4-5]。白樺脂酸(Betulinic Acid，BA)作為一種從五環三萜類化合物，具有顯著的抗炎、抗HIV、免疫調節及抗腫瘤作用[6-7]，可誘導白血病、肝癌等多種腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞卻沒有殺傷力[8-9]。BA聯合硼替佐米對MM細胞株U266細胞的作用機制尚不清楚[10]，本研究采用BA聯合硼替佐米誘導U266細胞的凋亡，探討其凋亡的可能機制。

1材料和方法

1.1材料

人MM細胞 U266(獲贈于湘雅醫學院附屬第2醫院血液科)。BA購于Alexis公司，硼替佐米購自美國Millennium公司，RPMI-1640培養基、胎牛血清均購于Gibco公司；β-actin、Survivin、BCL-2、Bax及Cyto-c單克隆抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司，AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT購于美國AxyPrep公司，PrimeScriptTMRT reagent KIT、SYBR Premix Ex TapTM實時熒光定量 PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養U266細胞接種于含15%的RPMI-1640培養基中，37 ℃,5%CO2條件下培養，隔天換液，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.2.2細胞增殖抑制率檢測 U266細胞按5×103個/孔接種于96孔板，在37 ℃，5% CO2條件下培養，分別用BA(20、40、60及80 mg/L)、硼替佐米(10、80及320 nmol/L)和40 mg/L BA分別聯合10、80及320 nmol/L硼替佐米(聯合1～3組)處理U266細胞，每種濃度設5個復孔，同時設對照組，于5% CO2，37 ℃的培養箱中培養(BA組分別培養24 h、48 h及72 h，硼替佐米組和聯合1～3組培養48 h)，然后每孔加入5 g/L MTT溶液10 uL，繼續溫育4 h，終止培養，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩10 min，使結晶充分溶解，并用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度(OD)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。根據增殖抑制率和濃度計算藥物誘導腫瘤細胞凋亡50%的濃度(IC50)值，IC50=lg-1[Xm-I(ΣP-0.5)](Xm,設計的最大藥物濃度的對數值；I,各濃度倍比濃度的對數值；ΣP,各組生長抑制率之和；0.5為經驗常數)，根據IC50值求得最適濃度。以BA和硼替佐米最適濃度及二者聯合分別處理U266細胞48 h后進行Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax mRNA和蛋白表達水平的檢測，同時設對照組。

1.2.3檢測Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax mRNA 采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法，分別取對照組、BA(40 mg/L)組、硼替佐米(80 nmol/L)組及40 mg/L BA聯合80 nmol/L硼替佐米(聯合4組)U266細胞，用AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT試劑盒提取細胞總RNA；按PrimeScriptTMRT reagent KIT和SYBR Premix Ex TapTM實時熒光定量 PCR試劑盒說明書分別進行cDNA的合成和Real-time PCR反應，以β-actin作為內對照。各基因引物序列見表1。

表1　Survivin、BCL-2 、Bax、 Cyto-C及β-actin引物序列

1.2.4檢測Survivin，Cyto-C，BCL-2，Bax蛋白表達 采用Western blot法，按照1.2.3方法取U266細胞，加入了細胞裂解液后冰上孵育30 min，超聲粉碎儀進行超聲粉碎。4 ℃ 12 000 rm/min離心20 min，取少量上清以Bradford 法測定蛋白濃度。取25 μg 蛋白經12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 電轉移至PVDF 膜上，PVDF 膜經封閉液室溫封阻1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜。用辣根過氧化物酶標記的二抗檢測蛋白表達。并用β-actin作為內參，計算Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax蛋白的表達。

1.3統計學處理

所得數據采用SPSS 17.0統計軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1BA、硼替佐米及BA聯合硼替佐米對U266細胞增殖的影響

單用BA和硼替佐米處理U266細胞隨著藥物的濃度增加增殖抑制率顯著升高，且BA還隨處理時間的延長也增強，各組比較差異有統計學意義 (P<0.05);而硼替佐米組增殖抑制率明顯高于聯合1～3組(P<0.05)；BA處理U266細胞24、48及72 h的IC50值分別為(76.27±1.83)、(42.80±2.18)及(29.64±2.53)mg/L，3者比較差異有統計學意義(P<0.05)；硼替佐米組IC50值為(69.71±2.82)nmol/L，根據IC50計算出BA和硼替佐米作用于U266細胞最適濃度分別為40和80 nmol/L。見圖1。

2.2檢測Survivin、Cyto-c、BCL-2及Bax mRNA 和蛋白表達

與對照組相比，單用BA組或硼替佐米組 Survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白表達顯著降低，Cyto-C、Bax的mRNA和蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與BA組和硼替佐米組比較，聯合4組Cyto-C和Bax的mRNA及蛋白表達水平顯著升高，Survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(p<0.05)。見圖2、圖3。

圖1　BA、硼替佐米及BA聯合硼替佐米對U266細胞增殖抑制的影響. Fig .1　The inhibitory effects of BA, bortezomib and BA combined with bortezomib on proliferation of U266 cells.

3討論

MM是骨髓漿細胞惡性疾病，臨床上沙利多胺、馬法蘭等化療藥物均作為治療MM首選藥[11]。目前大多數MM患者的壽命得以延長，生活質量提高，但MM的化療效果不持久易復發、易產生耐藥性、副作用多等因素在臨床治療中仍難以攻克[12-13]。在本研究中，分別單用BA、硼替佐米以及BA聯合硼替佐米共同處理體外培養的U266細胞，實驗結果表明，單用BA或硼替佐米處理U266細胞，隨著藥物的濃度增加增殖抑制率顯著升高，且BA還隨處理時間的延長也增強對U266細胞的增長抑制率(P<0.05)，但單用硼替佐米硼替佐米組可能由于耐藥導致增殖抑制率明顯低于BA聯合硼替佐米用藥組，這提示BA聯合硼替佐米用藥可以誘導U266細胞凋亡，為臨床治療MM疾病提供了新的治療思路。

誘導細胞凋亡已成為腫瘤治療研究中的一項重要課題。通過信號通路激活或抑制，使細胞產生一些凋亡蛋白，并具有較強的抑制細胞增殖和凋亡能力，如BCL-2、Bax、Cyto-c等。本實驗研究表明，單用硼替佐米組或BA組Survivin、 BCL-2的mRNA及蛋白表達較對照組顯著降低，而Cyto-C，Bax mRNA和蛋白表達顯著升高，同時聯合組較單用硼替佐米組和BA組Cyto-C和Bax mRNA及蛋白表達也顯著升高，Survivin，BCL-2 mRNA及蛋白表達明顯降低，提示經BA聯合硼替佐米處理U266細胞后，可以上調Cyto-C、Bax基因表達水平，下調Survivin、Bcl-2基因表達水平，促進腫瘤細胞凋亡，抑制其生長，說明BA聯合抗腫瘤藥物誘導U266細胞凋亡可能是通過上調促凋亡因子的表達及下調抗凋亡因子的表達來實現。

(1)與對照組相比，P<0.05； (2) 與BA組相比，P<0.05； (3)與硼替佐米組相比，P<0.05 圖2　處理后U266細胞中Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA表達水平 Fig. 2　Effect of betulinic acid combined with bortezomib on the mRNA expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax

A為對照組， B為BA組，C為硼替佐米組，D為聯合4組 (1)與對照組相比，P<0.05； (2) 與BA組相比，P<0.05； (3)與硼替佐米組相比，P<0.05 圖3　處理后U266細胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2的mRNA及Bax蛋白表達水平 Fig. 3　Effect of betulinic acid combined with bortezomib on mRNA levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，and protein levels of Bax.

4參考文獻

Pluta RM，Lynm C，Glass RM．Multiple myeloma[J]．JAMA，2010 (21)：24-30.

[2]Alexanian R, Delasalle K, Wang M, et al. Curability of multiple myeloma [J]. Bone Marrow Res, 2012 (91)：64-79.

[3]Reece D. Update on the initial therapy of multiple myeloma [J].Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2013(33):307 -312.

[4]Kastritis E，Zervas K，Symeonidis A，et al．Improved survival of patients with multiple myeloma after the introduction of novel agents and the applicability of the International Staging System (ISS)：an analysis of the Greek Myeloma Study Group (GMSG)[J]．Leukemia，2009 (6)：1152-1157．

[5]Rosifiol L，Oriol A，Teruel AI，et a1．Superiority of bortezomib，thalidomide．and dexamethasone(VTD)as induction pretransplantation therapy in multiple myeloma：a randomized phase 3 PETHEMA/GEM study [J]．Blood，2012 (8)：1589-1596．

[6]Yu D，Morris-Natschke SL，Lee KH，et al．New development in natural products based anti-AIDS research [J]．Med Res Rev，2007 (1)：108-132．

[7]Mukherjee R，Kumar V，Srivastava S K，et al．Betulinic acid derivatives as anticancer agents：structure activity relationship [J]．Anticancer Agents IVied Chem，2006 (6)：271-279．

[8]Kikucht T, Akazawa H, Tabaka K, et al. 3-O-(E)-p-coumaroyl tormentic acid from eriobotrya japonica leaves induces caspase-dependent apoptotic cell death in human leukemia cell line[J]. Chem Pharm Bull, 2011 (3):378-381.

[9]Szuster-ciesielsja A, lewka K, Danluk J, et al. Betulin and betulinic acid attenuate ethanol-induced liver stellate cell activation by inhibiting reactive oxygen species(ROS), cytokine (TNF-α, TGF-β) production and by influencing intracellular signaling[J]. Toxicology, 2011 (3): 150-163.

[10]Kessler J, Mullauer F, De roo G, et al. Broad in vitro efficacy of plant-derived betulinic acid against cell lines derived from the most prevalent human cancer types[J].Cancer Lett, 2007 (1): 132-145.

[11]Kumar SK, Rajkumar SV, Dispenzieri A, et al. Improved survival in multiple myeloma and the impact of novel therapies [J]. Blood, 2008 (5):2516-2520.

[12]Kim SJ，Kim K，Kim BS，et a1．Clinical features and surviva1 outcomes in patients with multiple myeloma：analysis of web-based data from the Korean Myeloma Registry[J]．Acta Haematol，2009 (4)：200-210．

[13]Jasielec JK, Jakubowiak AJ.Current approaches to the initial treatment of symptomatic multiple myeloma [J]. Int J Hematol Oncol, 2013 (1):133-139.

(2015-05-22收稿，2015-07-30修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌

中醫古代文獻的引用規范

中醫論著中或多或少會引用中醫古代文獻的內容，因其特殊性，現總結如下：

1.中醫古代文獻原則上應引用第一手材料，即單行本，古代的一些類書、叢書，如《醫部全錄》《徐氏醫書八種》，多為后人所集，非原著者所撰，容易有抄寫之誤，盡量不選。

2.引用時盡量選用最早的或學術界公認最好的版本，如《素問》以選趙開美的本子為宜，以防以訛傳訛，并要整句引用，不可斷章取義，以免產生誤解。

3.書名要注意寫全稱，以免混淆。如《備急千金藥方》不能寫成《千金方》，是為了與孫思邈的《千金翼方》區別。

4.引用中醫文獻的出處(也稱書證)要列到2級或3級，要視書的規模和標題層次而定，原則是便于讀者查找原文，如《濟陰綱目·調經門·脈法》；但其中“卷”、“篇”會因書的版本不同而不盡相同，所以不作為一級的單位。

5.引用文獻中的計量單位多與現代用法不同，如斤、兩、錢、匕、字等，即使“克”，古代用量也與現代不同。為安全起見，應依據《量和單位》、《中華人民共和國藥典》等國家標準折合成克，并在括號中注明。

《貴陽醫學院學報》編輯部