Wnt信號通路的組件蛋白DKK-1、β-鏈接素及周期素D1蛋白表達與胃癌的相關性

Wnt信號通路的組件蛋白DKK-1、β-鏈接素及周期素D1蛋白表達與胃癌的相關性

李春輝潘理會1佟曉波1謝立德1

(承德醫學院附屬醫院病理科，河北承德067000)

摘要〔〕目的探討Wnt信號通路中的組件蛋白DKK-1、β-catenin及周期素(Cyclin)D1在胃癌的發生、發展及轉移的相互關系。方法采用免疫組織化學方法標記DKK-1、β-catenin及CyclinD1蛋白在80例胃癌組織標本，10例正常胃組織中的表達情況。結果①DKK-1在胃癌組織中的表達明顯低于胃正常組織(P<0.05)，高、中分化胃癌的表達高于低分化胃癌的表達(P<0.05)，伴有淋巴結轉移的胃癌組織DKK-1較無轉移病例陽性率低(P<0.05)。②β-catenin在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于胃正常組織(P<0.05)，高、中分化胃癌的表達低于低分化胃癌的表達(P<0.05)，伴有淋巴結轉移的胃癌組織β-catenin較無轉移病例陽性率高(P<0.05)。③CyclinD1在胃癌組織中的表達明顯高于胃正常組織(P<0.05)，高、中分化胃癌的表達低于低分化胃癌的表達(P<0.05)，伴有淋巴結轉移的胃癌組織CyclinD1較無轉移病例陽性率較高(P<0.05)。④在胃癌組織中DKK-1與CyclinD1呈負相關關系(r=-0.453，P<0.01)，DKK-1與β-catenin呈負相關關系(r=-0.553，P<0.01)，CyclinD1與β-catenin呈正相關關系(r=0.562，P<0.05)。結論Wnt信號通路中的組件蛋白DKK-1、β-catenin及CyclinD1在胃癌的發生、發展及轉移有一定的相互關系。

關鍵詞〔〕胃癌； Wnt信號通路；DKK-1； β-catenin；CyclinD1； 免疫組化

中圖分類號〔〕R735.2〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省2014年政府資助臨床優秀人才計劃暨河北省醫學科學重點課題(ZL20140103)

1承德醫學院生物醫學工程系

第一作者：李春輝(1963-)，男，主任醫師，教授，博士，博士生導師，主要從事胃癌的基礎與臨床研究。

Wnt信號通路的異常與胃癌的發生有著密切的關系，Wnt信號通路由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，它們之間彼此聯系、相互制約〔1〕。關于Wnt信號通路的β-catenin、DKK-1蛋白及CyclinD1在胃癌發生、發展中相互關系的研究目前國內外尚未見報道。本文用免疫組織化學的方法對三者之間的關系進行探討。

1材料與方法

1.1標本來源收集承德醫學院附屬醫院2009年9月至2011年3月手術切除經病理證實的胃癌組織標本80例，正常胃組織(距離腫瘤5 cm以外)10例。其中男性59例，女性21例，年齡43～77歲，中位年齡57歲；組織分化程度：高中分化者35例，低分化者45例；無淋巴結轉移30例，有淋巴結轉移50例。

1.2主要試劑鼠抗人DKK-1、β-catenin、CyclinD1抗體購于福州邁新生物公司。

1.3免疫組織化學染色及定量分析組織切片加一抗DKK-1、 β-catenin和CyclinD1，DAB顯色，蘇木素復染核，常規脫水、透明封片，另外，部分組織切片用PBS替代DKK-1、β-catenin和 CyclinD1抗體(其余染色步驟相同)作為陰性對照。用已知陽性標本作陽性對照。DKK-1和β-catenin蛋白陽性信號主要表達于細胞質，CyclinD1蛋白陽性信號主要表達于細胞核，采用Volm雙評分法進行判定〔2〕在染色均勻的區域，選取5個高倍鏡視野(×400)：①按陽性細胞百分率(A值)評分：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分；②按染色強度(B值)評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合染色陽性細胞數(A值)與染色強度(B值)相加判斷結果：陰性(-)：0分，弱陽性(+)：1～2分，中度陽性()：3～4分，強陽性()：5～6分。

1.4統計學方法采用SPSS13.0軟件進行秩和檢驗。

2結果

2.1DKK-1蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的表達 DKK-1蛋白在胃癌組織中的表達低于在正常胃組織中的表達(P<0.05)，高-中分化腺癌與低分化腺癌二組比較高中分化腺癌表達高于低分化腺癌的表達(P<0.05)，無淋巴結轉移者DKK-1的表達與有淋巴結轉移者的DKK-1表達，無淋巴結轉移DKK-1表達高于有淋巴結轉移組(P<0.05)，浸潤深度間差異顯著(P<0.05)，TNM分期間差異顯著(P<0.05)，但DKK-1的表達在年齡、性別間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1，圖1。

表1DKK-1蛋白在不同胃黏膜組織中的表達(n)

分組nDKK-1蛋白表達強度-+P值正常組101225胃腺癌組805114960.013分化程度高中分化35151073低分化45356220.018淋巴結轉移無3011865有50406310.007

2.2β-catenin蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的表達 β-catenin蛋白在胃癌中的表達強于正常胃黏膜(P<0.05)，高-中分化腺癌與低分化腺癌比，低分化者中β-catenin蛋白的陽性表達高于高-中分化者，二者差異有顯著性(P<0.05)，β-catenin蛋白在有淋巴結轉移組中的表達高于有淋巴結轉移組(P<0.05)，浸潤深度間差異顯著(P<0.05)，TNM分期間差異顯著(P<0.05)，但β-catenin的表達在年齡、性別間差異無統計學意義(P>0.05)，見表2，圖2。

表2β-catenin蛋白在不同胃黏膜組織中的表達(n)

分組nβ-catenin蛋白表達強度-+P值正常組105311胃腺癌組80241018280.002分化程度高中分化3515974低分化456413220.016淋巴結轉移無3012675有5010912190.019

2.3CyclinD1蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的表達CyclinD1在胃癌中的表達高于正常胃黏膜組，二者之間比較差異有顯著性(P<0.05)，低分化腺癌中CyclinD1的陽性表達程度高于高中分化者(P<0.05)，CyclinD1蛋白在有淋巴結轉移組中的表達高于有淋巴結轉移組差異顯著(P<0.05)，浸潤深度間差異顯著(P<0.05)，TNM分期間差異顯著(P<0.05)，但CyclinD1的表達在年齡、性別間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3，圖3。

2.4DKK-1、β-catenin 和CyclinD1蛋白在胃癌中表達的相關性在胃癌組織中DKK-1與CyclinD1呈負相關(r=-0.453,P<0.05)，DKK-1與β-catenin呈負相關(r=-0.553,P<0.05)，CyclinD1與β-catenin呈正相關(r=0.562,P<0.05)。

表3CyclinD1蛋白在不同胃黏膜組織中的表達(n)

分組nCyclinD1蛋白表達強度-+P值正常組106310胃腺癌組80281020220.015分化程度高中分化3517774低分化4511313180.021淋巴結轉移無3015645有5013416170.025

正常胃黏膜

胃高中分化腺癌

胃低分化腺癌

圖1DKK-1蛋白在不同胃黏膜中的表達(IHC,×200)

正常胃黏膜

胃高中分化腺癌

胃低分化腺癌

圖2β-catenin蛋白在不同胃黏膜中的表達(IHC，×200)

正常胃黏膜中

胃高中分化腺癌

胃低分化腺癌

圖3Cyclin D1蛋白在不同胃黏膜組織中的表達(IHC，×200)3討論

Wnt信號通路由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質組成，DKK-1最初是一個隱匿的蛋白質，而后作為Wnt信號通路的抑制因子而被人所知〔3〕。DKK-1的甲基化作用與其在胃癌組織中表達下調顯著相關聯，研究結果顯示在胃癌中促甲基化作用是DKK家族沉默的一個重要機制，國內外關于胃癌中DKK1的研究較少Veeck等〔4〕報道，DKK1在正常及胃癌組織中被沉默，而Ueno等〔5〕報道DKK1在胃癌組織中部分部分下降表達，部分上升表達，由此可見關于DKK-1在胃癌組織中的表達情況的結論不統一，本研究表明DKK-1蛋白在胃癌組織中的表達明顯低于正常胃組織，高中分化胃癌的表達高于低分化胃癌的表達，伴有淋巴結轉移的胃癌組織較無淋巴結轉移者的DKK-1蛋白標記陽性率低，該結果與Ueno等〔5〕等報道有部分相同之處。

β-catenin作為 Wnt信號通路的蛋白構成組件調控細胞的生長，β-catenin蛋白能將細胞黏附和細胞骨架的組成與細胞擴增及分化相關，Wnt信號通路成分β-catenin的突變致其不恰當的激活可能與消化道腫瘤的發生、發展有關，因為Wnt信號通路中β-catenin蛋白結構突變，信號通路就出現異常，β-catenin在細胞內就會集聚，并進入細胞核內激活相關靶基因CyclinD1的轉錄，導致細胞發生癌變〔6,7〕，王渝等〔8〕研究發現胃腺癌中存在β-catenin基因的失活以及蛋白表達下調，并出現細胞質和(或)細胞核等各種形態的異常表達。同時隨著胃癌分化程度的降低、浸潤深度的增加、TNM分期的進展β-catenin異常表達顯著增強，馮紅等〔9〕闡明β-catenin在正常胃黏膜、癌旁組織及胃癌組織中的表達呈下降趨勢，在胞質中表達強度呈增強趨勢，本研究發現，β-catenin表達其與組織分化程度、分期和預后有顯著相關性，從正常胃黏膜上皮到胃癌的發展過程中，β-catenin蛋白表達在胞質中增加，β-catenin在低分化胃癌中的表達陽性率顯著高于高中分化胃癌，有淋巴結轉移的胃癌β-catenin表達陽性率高于無淋巴結轉移者，因此本研究結果與馮紅等〔9〕闡明的觀點一致。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，若細胞周期調控異常將出現細胞生長失控則可能發生癌變〔10〕，本研究發現，CyclinD1在胃癌中的表達比率明顯高于正常胃黏膜，低分化胃癌的表達高于高中分化胃癌，而且在分化程度越低的癌腫表達率越高， Wnt/β-catenin信號轉導通路在生物進化中極為保守,在Wnt/β-catenin信號轉導通路中，β-catenin是一種重要的胞內蛋白,是Wnt信號轉導通路中致癌的關鍵分子,其降解障礙致使胞質內游離的β-catenin積累,激活下游靶基因CyclinD1的轉錄,引起細胞增殖和分化失控,導致腫瘤發生，而且CyclinD1是Wnt通路中的核心環節，本研究發現，CyclinD1在胃癌中的表達比率明顯高于正常胃黏膜，低分化胃癌的表達高于高中分化胃癌，而且在分化程度越低的癌腫表達率越高， DKK1是Wnt /β-catenin 經典信號傳導通路的拮抗分子，通過Wnt 信號轉導途徑來調控細胞的分化、增殖、遷移或癌變。Veeman等〔11〕發現，轉染DKK1 的宮頸癌Hela 細胞，其增殖受到明顯抑制，高表達的DKK1 可抑制Hela 細胞的生長并誘導凋亡。Nalesso等〔12〔13〕分別對食管癌和胰腺中的研究中也得到類似的結果。但研究顯示DKK-1也是β-catenin 調控的靶基因之一，在其啟動子區域有多個β-catenin/TCF 結合位點，引導經典Wnt通路的Wnt或者異位表達的β-catenin、TCF 或者LRP6 突變體可以誘導人Dkk-1 基因的轉錄，這顯示在Dkk-1和β-catenin 之間存在一個負反饋作用〔12〕。本實驗結果顯示，在胃癌中β-catenin和CyclinD1蛋白的表達呈正相關，而DKK和β-catenin蛋白的表達之間呈負相關。該結果上述文獻報道的結論基本一致，但是DKK和CyclinD1蛋白的表達亦呈負相關，該結果是否受β-catenin蛋白作用的影響，還有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2013-09-16修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)