EGF—Linker—TCSKDEL融合蛋白的構(gòu)建及表達產(chǎn)物的純化

摘要：目的 構(gòu)建EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白表達載體并純化目的蛋白。方法 以天花粉蛋白基因的改造產(chǎn)物TCSKDEL為毒素，人表皮生長因子EGFR為載體，構(gòu)建重組免疫毒素 EGF-Linker-TCSKDEL。PCR方法擴增 EGF-Linker-TCSKDEL 基因片段，插入表達載體PET28a中并誘導(dǎo)表達，使用Ni-NTA Agrose親合層析純化。結(jié)果 該融合蛋白以可溶形式表達于大腸桿菌培養(yǎng)上清中，并獲得有效純化。結(jié)論 成功構(gòu)建了新型融合蛋白EGF-Linker-TCSKDEL，為其進一步的基礎(chǔ)和臨床研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：融合蛋白； 表皮生長因子；天花粉蛋白

Construction and Purification of EGF-Linker-TCSKDEL Fusion Proteins

LI Yu-ping

（School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract：Objective To construct the expression vector of EGF-Linker-TCSKDEL fusion proteins and purify target protein. Methods Recombinant immunotoxin （EGF-Linker-TCSKDEL） was constructed by modified trichosanthin （TCS） with KDEL as toxin and epidermal growth factor （EGF） as a carrier. The DNA fragment of EGF-Linker-TCSKDEL was amplified by using PCR， and the fusion proteins were purified by Ni-NTA Agrose affinity chromatography. Results The fusion protein was expressed in a form of soluble protein and purified effectively using affinity chromatography. Conclusion A new EGF-Linker-TCSKDEL fusion proteins was successfully prepared. It laid a foundation of further research in basic and clinical of EGF-Linker-TCSKDEL.

Key words：Fusion protein；Epidermal growth factor；Trichosanthin

天花粉蛋白（Trichosanthin ，TCS）是從葫蘆科植物栝樓塊根中提取的I型核糖體滅活蛋白[1]，臨床常用于中期妊娠引產(chǎn)。深入研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白在體內(nèi)體外對多種腫瘤細胞具有細胞毒性，可以充當(dāng)配子用于生物導(dǎo)彈[2、3]。人表皮生長因子（EGF）是一種重要的生長因子，它的過度表達常與許多惡性腫瘤的預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快和生存期短等有關(guān)[4，8]。EGF受體抑制劑可能是通過促進細胞凋亡、抗血管生成、抗細胞分化增殖和遷移等方面而實現(xiàn)其抗腫瘤的作用[9]。EGF可以競爭結(jié)合癌細胞表面受體，所以，EGF可以作為融合蛋白的配子，攜帶毒素特異的殺傷癌細胞[10]。KDEL是一段高疏水的序列，PE毒素的C末端加上KDEL序列可以顯著提高PE殺傷腫瘤細胞的作用。我們設(shè)想將KDEL序列加在TCS的C末端可能提高TCS抗腫瘤的活性，本研究擬將KDEL序列加在EGF-Linker-TCS的C末端，構(gòu)建并純化該融合蛋白，為探索該重組融合蛋白在腫瘤治療方面的潛力，研究相關(guān)作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1質(zhì)粒、菌株及試劑 克隆菌JM105、表達菌M15及EGF-linker-TCS由本室保存；工具酶及限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；純化試劑盒購自QIAGEN公司，兔抗6HIS，羊抗兔IgG購自深圳勤保升生物科技有限公司。

1.2 EGF-Linker-TCSKDEL基因的擴增 參照楊海文博士[11]設(shè)計引物，在EGF的N端加上六個HIS的序列用于親合層析，TCS的C端加上KDEL的編碼序列（斜體）：5′-gcgcccatgggacatcatcatcatcatcacaactccgactccgaatgtccg-3′ 5′- cgcgaattcttacagttcatcttttgc catcttgtttcg-3′，PCR擴增條件為94℃30s， 60℃30s， 72℃40s；72℃延伸5Min ，PCR擴增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 EGF-linker-TCSKDEL基因的克隆及表達載體的構(gòu)建 用QIAGEN公司的PCR產(chǎn)物快速純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，，NcoI內(nèi)切酶酶切，EcoRI內(nèi)切酶酶切PET28a表達載體，回收酶切片段。將回收的片斷用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化JM105宿主菌中。

1.4 EGF-linker-TCSKDEL的表達及免疫印跡分析 將鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至M15表達菌，挑單菌落接種，37℃搖床培養(yǎng)8h。而后取該培養(yǎng)物按比例接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6時，加入IPTG誘導(dǎo)表達3h，取樣做SDS-PAGE分析，薄層掃描測定目的蛋白表達量。將誘導(dǎo)表達后的重組蛋白200ug及M15菌體蛋白（陰性對照）轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，BSA封閉，與一抗（His）反應(yīng)1h，PBS洗滌后與二抗反應(yīng)1h，緩沖溶液洗滌后DAB顯色[12]。

1.5 EGF-Linker-TCSKDEL的純化 IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達EGF-linker-TCSKDEL3 h，超聲波破碎菌體，離心后取上清液，用Ni-NTA Agrose親和純化，純化的樣品做聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結(jié)果

2.1 EGF-linker-TCSKDEL的PCR擴增 擴增的EGF-linker-TCSKDEL基因純化后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在900bp處可見特異性擴增帶，見圖1。

圖1 EGF-linker-TCSKDEL的PCR擴增

2.2 EGF-linker-TCSKDEL表達載體的構(gòu)建 與pET28a載體連接的EGF-linker-TCSKDEL基因片段轉(zhuǎn)化至JM105菌后經(jīng)PCR鑒定為陽性菌落，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。用SphI/EcoRI和NcoI/EcoRI雙酶切鑒定，在750bp和900bp處可見條帶，見圖2。

圖2 重組子的限制性酶切鑒定

2.3 EGF-Linker-TCSKDEL基因的表達及純化和免疫印跡分析 IPIG誘導(dǎo)表達的工程菌經(jīng)SDS-PAGE顯示有蛋白帶，相對分子質(zhì)量為31000，而未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌在此處未見蛋白帶，見圖3。Western blotting分析結(jié)果顯示IPIG 誘導(dǎo)表達的工程菌樣品在NC膜其相應(yīng)分子質(zhì)量處可見特異性帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌未見特異帶，見圖4。

3 討論

免疫毒素（ immunotoxins ）是一組人工構(gòu)建的具有特異性殺傷靶細胞能力的雜合分子，在細胞培養(yǎng)水平能選擇性結(jié)合并殺傷腫瘤細胞[13]。免疫毒素可特異性殺傷靶細胞，而對正常細胞無毒害作用，因此，作為最具代表性的靶向治療藥物，其在治療腫瘤和自身免疫性疾病及抗免疫排斥反應(yīng)等方面具有良好的應(yīng)用前景[14，15]。天花粉蛋白屬于I型核糖體失活蛋白，只有A鏈，沒有與細胞結(jié)合的B鏈，單獨的天花粉蛋白很難進入細胞，因此對完整細胞的毒性很低[16]。所以，把單鏈毒素和單克隆抗體偶聯(lián)或與細胞因子連接后形成雜交分子，能特異性地殺傷靶細胞，從而在靶向治療中有廣泛的應(yīng)用價值。

李詠梅[17]克隆了EGF-Linker-TCS，并初步探討了其抗腫瘤的功效。結(jié)果顯示EGF-Linker-TCS可以抑制荷瘤小鼠瘤體的生長，其抗腫瘤的功效與誘導(dǎo)癌細胞的凋亡及抑制腫瘤血管的生成有關(guān)。為提高融合蛋白的活性，本文在EGF-Linker-TCS的基礎(chǔ)上，成功的構(gòu)建融合蛋白EGF-Linker-TCSKDEL并在大腸桿菌中高效表達，試圖為腫瘤的靶向治療提供療效更好、特異性更強的融合蛋白。本研究中我們使用PCR方法將KDEL序列加在TCS的C末端提高重組蛋白的活性，同時使用了含T7啟動子和終止子的載體PET28a，表達更高效穩(wěn)定，為下一步高密度發(fā)酵打下基礎(chǔ)

參考文獻：

[1]Shaw PC， Chan WL， Yeung HW， etal. Minireview： trichosanthin-a protein with multiple pharmarcological properties[J]. Life Sci， 1994， 55（4）：253-262.

[2]Cai Y， Xiong S， Zheng Y，et al. Trichosanthin enhances antitumor immune response in a murine Lewis lung cancer model by boosting the interaction between TSLC1 and CRTAM[J]. Cell Mol Immunol ，2011，8（4）：359-367.

[3]Li M， Li X， Li JC. Possible mechanisms of trichosanthin-induced apoptosis of tumor cells[J]. Anat Rec （Hoboken）， 2010， 293： 986-992.

[4]Papageorgio C，Perry MC. Epidermal growth factor receptor-targeted therapy for pancreatic cancer[J]. Cancer Invest 2007，25（7）：647-657.

[5]Andersen JB， Spee B， Blechacz BR，et al. Genomic and Genetic Characterization of Cholangiocarcinoma Identifies Therapeutic Targets for Tyrosine Kinase Inhibitors[J]. Gastroenterology，2011.

[6]Sally M， Massimiliano P， Francesca M， et al. Soluble epidermal growth factor receptor isoforms in non-small cell lung cancer tissue and in blood[J].Lung Cancer ，2011.

[7]Moise M， Motoc A， R ducan A， et al. Human epidermal growth factor receptor 2 （HER2/neu） supraexpression in the mammary tumors[J]. Rom J Morphol Embryol， 2011，52（3 ）：1101-1105.

[8]. Perona R. Cell signaling： growth factors and tyrosine kinase receptors[J]. Clin Transl Oncol ，2006，8 （2）：77-82.

[9]Sakaeda T， Okamura N， Gotoh A， et al.EGFR mRNA is upregulated， but somatic mutations of the gene are hardly found in renal cell carcinoma in Japanese patients[J]. Pharm Res， 2005 ，22（10）：1757-1761.

[10]Langer CJ， Natale RB. The emerging role of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors[J]. Semin Oncol， 2005，32 （6 Suppl 10）：S23-S29.

[11]楊海文. 靶向抗腫瘤EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白的研制及其生物活性研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)，2008，4：5-6.

[12]李詠梅， 楊海文， 羅 仁. 人表皮生長因子-天花粉蛋白融合蛋白的基因克隆、表達及純化[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，27（2）：205-207.

[13]Strome SE，Sausville EA，Mann D.A mechanistic perspective of monoclonal antibodies in cancer therapy beyond target-related effects[J] .Oncologist，2007， Sep；12（9）：1084-1095.

[14]吳昊，陸強，高聞達，等. 重組免疫毒素 EBI3-Luffin P1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、表達及其生物學(xué)活性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2012，25（3）： 324-328.

[15]Wang R， Gan CJ， Gao W， et al. A novel recombinant immunotoxin with the smallest ribosome-inactivating protein Luffin P1： T-cell cytotoxicity and prolongation of allograft survival [J]. J Cell Mol Med， 2010， 14（3）： 578-586.

[16]Shaw PC， Lee KM， Wong KB. Recent advances in trichosanthin， a ribosomeinactivating protein with multiple pharmacological properties[J]. Toxicon， 2005， 45：683-689.

[17]李詠梅， 陳金龍， 楊海文等. EGF-Linker-TCS融合蛋白誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細胞凋亡[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2007，7（1）： 34-37.

編輯/馮焱