微生物來源溶栓酶的研究進展

摘要：血栓是心血管疾病的主要成因之一，纖維蛋白是血栓的主要蛋白成分，常用溶栓藥物主要是各類溶解纖維蛋白的纖溶酶。本文綜述了目前各類微生物中發現的溶栓類物質及其研究進展。

關鍵詞：微生物；血栓；溶栓藥物

心肌梗死、動靜脈血栓栓塞等心血管疾病是造成全球人口死亡的主要原因之一。目前臨床上使用的溶栓藥物主要是組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶等纖溶酶原激活劑。盡管應用廣泛，這些藥物價格昂貴、對纖維蛋白的特異性較低、出血危險等限制了這些藥物的使用，因此有待開發更為理想的溶栓藥物。微生物是溶栓藥物的重要來源，其種類繁多、代謝產物多樣化、生長周期短、生產成本低等特點，為篩選新型溶栓活性物質提供了豐富的資源。

1 幾種重要的微生物源溶栓藥物

1.1鏈激酶 1949年研究人員從β-溶血鏈球菌的發酵產物中發現鏈激酶（Streptokinase， SK），其分子量為47kD，由414個氨基酸組成，是最早應用于臨床的溶栓類藥物。SK通過與纖溶酶原以1：1的比例結合成SK-纖溶酶原復合物，然后暴露活化位點，激活纖溶酶原成為纖溶酶，從而進行血栓溶解。臨床應用表明SK有效且冠狀脈開通率高，但因具有天然的抗原性而時有嚴重的免疫反應發生，且極短的半衰期極大的影響藥效作用的發揮。

1.2 葡激酶 葡激酶（Staphylokinase， SaK）是由溶源性金黃色葡萄球菌分泌產生的一種由四種纖溶酶原激活因子構成的蛋白質家族，分子量均為16.5kD。SaK在血漿中同樣是與纖溶酶原形成復合物，激活纖溶酶原成為纖溶酶并溶解血栓。大量動物血栓模型實驗顯示， SaK溶解動脈血栓的效果要明顯優于SK。SaK具有極強的纖維蛋白特異性，當無纖維蛋白或血栓時，SaK-纖溶酶原復合物很快被2-抗纖溶酶滅活而不激活纖溶系統。雖然到目前為止尚未見SaK引起過敏反應的報道， 但SaK來源于細菌，仍然有著潛在的免疫原性。

1.3納豆激酶 納豆激酶（Nattokinase， NK）是在納豆發酵過程中由納豆枯草桿菌產生的一種絲氨酸蛋白酶，由Sumi等在1987年發現。NK的分子量為27.7kD，在pH6～12.5的范圍內穩定，熱穩定性好，甚至在酸性環境下酶活也不會完全喪失，并已經從枯草桿菌中獲得了其基因aprN。在臨床實驗中，口服NK膠囊能明顯縮短優球蛋白溶解時間。NK具有纖溶活性外，還纖溶酶原激活劑，對交聯纖維蛋白有很強的水解活性，但對纖維蛋白原卻并不敏感，所以不易引起出血?；贜K來源于食源性微生物，無任何毒副作用，原料來源豐富，因而有很大的開發價值。

2 來源于其他微生物的溶栓藥物

2.1來源于鏈霉菌的纖溶酶 鏈霉菌是多數抗生素生產的重要菌種，次級代謝產物豐富，可同時分泌多種蛋白酶，且為非致病菌，因此研究該種菌產生的活性物質具有重要的實際意義。

中國醫學科學院篩選到產多種纖溶活性成分的鏈霉菌Y4051，并分離出了單亞基多肽鏈蛋白酶SW-1，可以直接降解纖維蛋白和纖維蛋白原，但不具有纖維蛋白特異性，可能造成系統性纖溶，因此在使用上受到一定限制。Chitte等2由鏈霉菌SD-5分離出來一種纖溶酶原激活劑，其相對分子量為35kD，最適pH值和溫度分別為8和55°C，它的一大優點是在工業上有可能在較低的成本下進行大規模生產。鞠秀云等3從鏈霉菌XZNUM00004發酵液中純化得到絲氨酸蛋白酶SFE1，其相對分子質量為20kDa，最適pH和最適溫度分別為7.8和35℃。SFE1纖溶活性高且有耐熱的優點，能夠快速水解纖維蛋白原的三條鏈。Mander等4分別從三株鏈霉菌菌株CS624、CS684和CS628發酵液中分離得到三種纖溶酶FES624、FP84和FP28，其中FP28的相對分子質量為17.6kDa，是目前為止報道的鏈霉菌產生的最小的纖溶酶，可在兩小時內分別水解纖維蛋白原的三條鏈，體外動物實驗表明其具有很好的溶栓活性，在未來可發展成為有前景的溶栓藥物。Uesugi等5從鏈霉菌中得到一種絲氨酸蛋白酶SOT，體外實驗結果表明，SOT的纖溶活性是纖溶酶的18倍，同時也具有纖溶酶原激活劑活性。SOT能夠迅速水解纖維蛋白原的A（-和B（-鏈，與納豆激酶具有纖溶協同效應，可作為一種有效的溶栓劑用來進行血栓的治療。

2.2海洋假單胞菌產生的溶栓活性物質 海洋微生物具有耐高壓、噬低溫、耐鹽等生理特性，被認為是獲取具有新型理化性質物質的又一重要來源。劉晨光等從海洋假單胞菌中提取得到一種分子量21kD的纖溶酶，最適pH值和最適溫度分別為8和50℃，且該酶具有降解苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽的活性。對于該酶還需對其結構、催化特征以及毒理藥效作用等作進一步研究，為進一步開發為新藥和發酵工業生產提供科學依據。

2.3其他 天津科技大學分離出一株中國根霉 12#，劉曉蘭等利用紫外線-氯化鋰復合誘變的方式，得到酶產量較出發菌株提高32.9%的穩定高產正突變株，并通過固體發酵分離純化得到分子量為18.0kD的纖溶酶，有直接降解纖維蛋白和纖溶酶原激活劑的的雙重溶栓作用。Wodeuk等6從芽孢桿菌CK-114的發酵產物中分離純化得到了枯草激酶CK，其分子量為28.2kD，最適pH值為7.0，且熱穩定性較好，具有纖溶活性和促纖溶活性。目前CK已在許多動物模型中表現出較理想的體內溶栓效果。此外Lee等7還從密環菌發酵物中分離到具溶纖作用的金屬蛋白酶，分子量為21kD，其最適pH值和溫度分別為6和 33°C，能有效水解纖維蛋白原。

3 分子生物學研究

目前國內外正致力開發新一代溶栓劑，如用蛋白質工程手段分子改造，通過定點突變或改變相關結構域等手段提高對纖維蛋白的特異性、延長半衰期以及發展導向性溶栓功能等。

1992年Nadamura等8確定了納豆激酶的基因序列和 氨基酸序列，為從基因工程角度提高納豆激酶的產量和活性提供了可能。2003年彭勇等克隆了豆豉溶栓酶基因，又將α-淀粉酶啟動子及信號肽與豆豉溶栓酶基因前肽及成熟肽序列融合，并將純化標簽His-Tag與豆豉溶栓酶基因融合，通過金屬親合柱進行純化，簡化純化步驟，提高回收率。不同溶栓酶間存在很高的同源性，解析這些酶的空間結構并用生物信息學確定酶的功能氨基酸，可通過定點突變改造基因以提高酶比活和纖維蛋白特異性。利用 DNA 重排等定向進化手段來改造纖溶酶， 將可以提高纖溶酶產品的功效。

4 結論及展望

隨著現代生物化學與分子生物學的發展，人們越來越關注微生物產生的溶栓活性物質，對產生大量蛋白酶的微生物進行篩選，并進行分離純化、功能研究與開發，以及通過不同的分子生物學手段對蛋白酶結構及基因進行改造，重組表達出優化溶栓物質，降低副反應，獲得工業化大規模生產，將成為這一領域今后的研究方向。

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編輯/王海靜