扶正剔邪搜絡方改善肺纖維化大鼠肺功能的機制研究

扶正剔邪搜絡方改善肺纖維化大鼠肺功能的機制研究

練毅剛1,張立山1,吳華陽1,閆玉琴2,王晨3,周紹忠1,關秋紅1,李德瑩1,蘇惠萍1*

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，100700；2.北京市隆福醫院，北京 100700；

3.懷柔區第一醫院，北京 100700)

摘要：目的通過扶正剔邪搜絡方治療肺纖維化大鼠，觀察不同時相大鼠肺功能與血清指標關系,探究其作用機制及適宜療程。方法將128只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、中藥組、激素組，每組32只。使用氣管內推注博萊霉素以建立肺纖維化模型，正常對照組注射相同體積的生理鹽水。造模后24 h，中藥組使用扶正剔邪搜絡方,0.74 g/(kg·d)，激素組使用潑尼松，5 mg/(kg·d)，正常對照組和模型組使用相同體積的生理鹽水。在用藥后第7、14、28、45 d時,分別觀察每組肺吸氣阻力(Ri)、順應性(Cl)、用力肺活量(FVC)、吸氣阻力(Ri)、呼出氣量為25%～75%肺活量時平均流量(FEF25%-75%)變化、第0.2秒末呼出容積(Fev0.2)。結果1)與模型組比較，中藥組14 d時FVC、FEF25%-75%、Cl顯著性升高(P<0.01)，28，45 d時Fev0.2、Ri、FEF25%-75%、Cl差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。2)Ⅲ型膠原14、45 d中藥組表達明顯低于模型組。3)中藥組Smad3、4蛋白表達明顯低于西藥組,Smad7蛋白表達明顯高于西藥組。結論扶正剔邪搜絡方可改善肺纖維化大鼠肺功能，其作用機制為調節Smad蛋白及降低Ⅲ型膠原蛋白表達來延緩肺間質纖維化的進展。

關鍵詞：扶正剔邪搜絡方；肺纖維化；肺功能；機制研究；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.04.031

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)04-0410-05

基金項目:北京市自然科學基金資助項目(7102096)。

作者簡介:練毅剛(1972-)，男，碩士研究生，主治醫師，主要從事中醫藥防治肺間質纖維化研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-09-21)

*通信作者:蘇惠萍,電話:010-84013357，電子信箱:suhuiping@126.com。

Mechanistic investigation of Fuzheng Tixie Souluo therapeutics on lung

function of pulmonary fibrosis rats

LIAN Yigang1,ZHANG Lishan1,WU Huayang1,YAN Yuqin2,WANG Chen3,ZHOU Shaozhong1,GUAN Qiuhong1,

LI Deying1,SU Huiping1*

(1.Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China;

2.Longfu Hospital of Beijing City,Beijing 100700,China;

3.The First Hospital of Huairou District,Beijing 100700,China)

Abstract:ObjectiveThrough Fuzheng Tixie Souluo therapeutics treatment for pulmonary fibrosis rat,observe the lung function of rat relation with serum index at various time phases and explore its mechanism of action and appropriate treatment.MethodsThe 128 SD male rats are divided into normal control group,model group,Chinese medicine group and hormone group at random,each of which has 32 rats.Except physiological saline of same volume is injected into the rats in normal control group,bleomycin is injected into the tracheas of the rats in each of other groups for modeling.After being modeled for 24 hours,Fuzheng Tixie Souluo therapeutics was used in Chinese medicine group,0.74g/(kg·d) administered;hormone group use prednisone,5 mg/(kg·d);meanwhile,the physiological saline of same volume is filled into the stomachs of the rats in other two groups till the previous day of use.On the 7 th day,14 th day,28 th day and 45 th day since administration,Observed in each group respectively the inspiratory resistance (Ri),compliance of lung (Cl),forced vital capacity (FVC),inspiratory resistance (Ri),exhaled air is 25%-75% vital capacity when the average flow rate change (FEF25%-75%),the 0.2 seconds end out of the volume (Fev0.2).Results1)Compared with the model group,on the 14th day,FVC,FEF25%-75%,Cl of Chinese medicine group obvious increase (P<0.01).On the 28 th and 45th days,forced expiration volume at 0.2 nd second (Fev 0.2),average expiration flow speed between expiration 25% VC and expiration 75% VC (FEF25%-75%),Ri and Cl are remarkably improved,the differences have statistical significances (P<0.01,P<0.05).2)Compared with that of the model group,the Co III in the Chinese medicine group is obviously weakened on the 14 th and 45 th days.3)The expressions of Smad 3 and Smad 4 in Chinese medicine group were weakened,while the expression of Smad 7 had enhanced.ConclusionFuzheng Tixie Souluo therapeutics can improve lung function of pulmonary fibrosis rats.The mechanisms may be related to the influenced by the regulation of the excessive expression of Smad,also followed the decline of Co Ⅲ.

Keywords:Fuzheng Tixie Souluo therapeutics;pulmonary fibrosis;lung function;mechanistic investigation;rat

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是多種病因導致的不同肺間質疾病的共同結局，具有致命性、進行性、慢性的疾病發展特點[1]。Dempsey等[2]報道IPF患者中位生存期約3年。本研究擬動態觀察扶正剔邪搜絡方治療博萊霉素致大鼠肺間質纖維化不同時相肺功能變化，通過分析不同時相Smad3、Smad4、Smad7信號蛋白及細胞外基質(Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原)指標的變化[3]，以期找到扶正剔邪搜絡方治療肺間質纖維化改善肺功能的作用機制。通過觀察大鼠造模后肺功能特點，對我院呼吸科治療肺間質纖維化用藥規律總結,自擬扶正剔邪搜絡方,觀察其對肺纖維化大鼠不同時相肺功能的作用，以期為中醫臨床治療肺間質纖維化的方法、時機及療程提供實驗依據并初步探討作用機理。

1材料與方法

1.1動物128只健康清潔級大鼠，體質量(200±20) g，雄性，動物許可證號：SCXK(京)2006-0009，提供方為北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2藥物與主要試劑扶正剔邪搜絡方顆粒劑，藥物組成：麥冬、人參、浙貝母、地龍、水蛭等8味中藥，7.440 g/袋，批號：100829，提供方為北京康仁堂藥業有限公司；鹽酸博萊霉素，15 mg/瓶，批號：Y91450，提供方為日本化藥株式會社；醋酸潑尼松龍，規格為：5 mL，0.125 g/支，批號：100514，浙江仙琚制藥股份有限公司。Smad3、Smad4及Smad7檢測試劑盒，北京尚柏生物有限公司。

1.3模型建立與分組大鼠128只，采用隨機數字表法,分為正常對照組、模型組、中藥組、激素組,每組32只。按照參考文獻[4-5]制造大鼠肺纖維化模型，采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉并固定，提起大鼠舌頭，用18號套管針從口腔水平插入，在到達咽喉部位時，壓低針尾，讓針頭抬高15°～30°，在插入氣管后，拔出針芯。使用棉球薄片，將其置于套管針外口，如果見到薄片隨呼吸前后運動，說明套管針已在氣管。此時通過氣管插管快速注射博來霉素溶液(濃度0.2%，用量5 mg/kg，即2.5 mL/kg)，正常對照組注射相同體積的生理鹽水；繼續通過氣管插管快速推注空氣0.3 mL，并將大鼠立即直立旋轉，以便藥液均勻分布在雙肺內。病理結果顯示，7 d時出現明顯肺泡炎，14 d可見肺泡炎較前減輕，肺間質纖維化開始形成，28 d時肺間質纖維化已經是主要病變，模型成功建立。

1.4給藥在造模24 h之后，中藥組參照人體與動物體表面積的折算系數,予以扶正剔邪搜絡方顆粒劑，劑量為0.74 g/(kg·d)，使用去離子水制成藥物混懸液；激素組給予醋酸潑尼松龍，劑量為5 mg/(kg·d)；模型組和正常對照組采用相同體積的生理鹽水灌胃給藥，1次/d。

1.5儀器動物呼吸機Res3020，動物肺功能分析系統AniRes2005(北京貝蘭博科技有限公司)。

1.6指標檢測

1.6.1肺功能檢測7，14，28，45 d，依據隨機數字表法各組取8只。因呼吸機與氣切插管后麻醉大鼠配合問題，導致7 d中藥組、激素組為7只，45 d正常對照組、激素組為7只。末次給藥后1 h使用水合氯醛(濃度為10%，劑量按3.5 mL/kg體質量)腹腔注射麻醉，行氣管切開，并將氣管導管插入，之后與動物肺功能分析系統連接，測算出每組大鼠呼出氣量為25%～75%肺活量時平均流量(FEF25%-75%)、第0.2秒末呼出容積(Fev0.2)、用力肺活量(FVC)、肺順應性(Cl)、吸氣阻力(Ri)。

1.6.2病理學檢測肺功能檢測后，摘取大鼠肺臟,使用多聚甲醛固定液(濃度為4%)固定左肺，常規脫水處理，使用石蠟包埋，切片厚度為5 μm，行Masson染色及HE染色。

1.6.3Smad3、Smad4及Smad7檢測在液氮中保存分離的右肺上葉，使用RT-PCR檢測,通過Bio Rad quanity one軟件定量分析條帶，內參抗體采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，使用Smad信號蛋白含量除以GAPDH，得出信號蛋白Smad的相對含量，盡量避免加樣誤差、RNA定量誤差以及各PCR反應體系中各孔間的溫差、擴增效率不均一等所造成的誤差。

2結果

2.1病理結果正常對照組在不同時相肺泡間隔均未發現明顯炎細胞浸潤。模型組7 d時,間質出現不同程度炎癥，Masson染色可以偶見少量膠原纖維[6]；14 d間質炎癥明顯，程度比7 d時減輕，而膠原纖維沉積增多明顯；28 d時肺組織炎癥較14 d程度減輕明顯，肺泡的正常結構破壞，纖維化區增大、增多；第45天時大部分肺組織正常結構破壞，大量膠原纖維在病變區域沉積，嚴重病變處形成分房囊性結構，即“蜂窩肺”改變，Masson染色可以見到大量致密膠原纖維。上述結果符合大鼠肺間質纖維化模型表現[7-8]。

2.2肺功能中藥組與模型組比較，7 d肺順應性(Cl)、吸氣阻力(Ri)開始改善，中藥組14 d時FVC、FEF25%～75%、Cl顯著性升高(P<0.01)，28，45 d時Fev0.2、Ri、FEF25%～75%、Cl差異有統計學意義(P<0.01，P<0.05)。

表1　不同時相各組大鼠肺功能比較 ± s)

注:與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01

2.3Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原相比正常對照組，模型組14，45 d時Ⅰ型膠原表達明顯升高。中藥組、激素組在不同時相Ⅰ型膠原表達無明顯改善。見表2。

相比正常對照組，模型組14、28、45 d時Ⅲ型膠原表達明顯升高。相比模型組，中藥組14、45 d時，Ⅲ型膠原表達明顯低于模型組。見表3。

2.4smad3、smad4、smad7干預組大鼠各時相Smad3、Smad4的表達值明顯低于模型組,Smad7表達水平均高于模型組，中藥組Smad3、4蛋白表達明顯低于西藥組，Smad7蛋白表達明顯高于西藥組。見表4～表6。

表2　各組不同時相Ⅰ型膠原表達結果 　ng/mL

注：同一時相，與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01

注：同一時相，與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01

注：同一時相，與激素組比較，## P<0.01；與模型組比較，△△ P<0.01

注：同一時相，與激素組比較，## P<0.01；與模型組比較，△△ P<0.01

注：同一時相，與激素組比較，##P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

3討論

“初病在經在氣”，肺纖維化發病初期邪氣入絡，病變部位主要在氣絡，此時病情變化快，傳變迅速[9],對應西醫分期為肺泡炎期，以肺泡炎癥滲出為主[10]；“久病入絡入血”，而隨著病情遷延，正消邪長，邪氣從淺表之絡傳入深部至脈絡，入絡為血絡，此時在肺氣虛損基礎上，虛、痰、瘀共同作用而致絡脈痹阻[11-12]，對應西醫分期為纖維化期，肺泡間隔纖維結締組織增生和纖維化形成。因此提出假說：“氣絡病向血絡病的進展過程是肺泡炎期向纖維化期的進展過程”，在治療上使用扶正剔邪搜絡方，麥冬、人參、五味子同用，養陰益氣潤燥，浙貝母等化痰散結，并針對絡病之瘀邪特點，選用蟲類藥地龍、水蛭等直入血分，搜剔絡脈，使干結難破之瘀得化，絡痹得開，結邪得去。

Smads蛋白家族是形成肺纖維化過程中信號轉導通路過程的重要環節，是公認形成肺間質纖維化的重要通道蛋白質[13]。在肺間質纖維化的不同時相,Smads蛋白表達水平不一，中藥組大鼠Smad3、4的表達值明顯低于西藥組(P<0.05),Smad7表達明顯高于西藥組(P<0.05)。14，45 dⅢ型膠原中藥組表達明顯低于模型組。而在肺功能表現上，中藥組7 d與模型組無顯著變化，14 d時Cl、FVC與模型組比較變化顯著,28,45 d Ri、Cl、Fev0.2、FEF25%-75%與模型組比較均有顯著變化，相比激素組有較明顯優勢。Smads蛋白與Ⅲ型膠原表達與肺功能情況吻合，說明扶正剔邪搜絡方既可通過影響信號傳導通路作用于肺泡炎早期，亦可通過減少細胞外基質的沉積(主要是Ⅲ型膠原)而作用于纖維化期[14-15],而Smads蛋白可能為中藥組方起到治療作用的主要靶點之一，亦從分子水平初步推斷肺纖維化相關的氣絡病向血絡病轉化過程的物質基礎。

研究中發現，7 d激素組肺功能FVC、Fev0.2均明顯改善，中藥組無明顯改善，病理發現中藥組第7、14天肺泡炎程度明顯輕于模型組(P<0.05),且較激素組輕，與肺功能不符，具體機制尚待進一步研究。

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