ARHI基因抑制U937白血病細胞株生長并誘導其G2/M期阻滯及凋亡

ARHI基因抑制U937白血病細胞株生長并誘導其G2/M期阻滯及凋亡*

陸英1△，劉相富1，劉玲玲2，李芳1，覃雪玲1，林東軍1, 2△

(中山大學附屬第三醫院1輸血科，2血液科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討抑癌基因ARHI在急性髓細胞白血病中的表達情況，同時探索其對U937細胞生長的影響。方法: RT-PCR方法檢測急性髓細胞白血病細胞株、人胚腎細胞293FT、白血病原代細胞以及健康志愿者血細胞中ARHI mRNA的表達情況。構建高表達ARHI的MSCV-IRES-GFP-ARHI 質粒轉染U937細胞，MTT法連續8 d檢測細胞活性繪制生長曲線。新鮮培養基重懸U937細胞24 h后，采用流式細胞術檢測細胞周期以及細胞凋亡。結果: 293FT細胞、健康志愿者血細胞中均檢測到ARHI mRNA表達，而白血病細胞株以及白血病患者原代細胞中未檢測到該基因的表達。生長曲線顯示高表達ARHI基因的U937(U937-ARHI)細胞在第6～8天細胞活力低于對照(U937-GFP)組。高表達ARHI的U937細胞G2/M期細胞比例及細胞凋亡率均高于對照組(P<0.05)。結論: ARHI在急性髓系白血病細胞中的表達減低；高表達ARHI基因能抑制U937細胞生長、阻滯其細胞周期在G2/M期并促進細胞凋亡。

[關鍵詞]ARHI基因； 急性髓細胞白血病； 細胞周期； 凋亡

[中圖分類號]R733.72[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.005

[文章編號]1000-4718(2015)11-1956-05

[收稿日期]2015-03-25[修回日期] 2015-09-24

[基金項目]*廣東省科技計劃(No．2012B031800063)；廣東省衛生廳基金資助項目(No. B2012111)

通訊作者△Tel: 020-85252230； E-mail： songwangcai@yahoo.com

ARHIgene inhibits cell growth, induces G2/M phase arrest and apoptosis of acute myeloid leukemia cell line U937LU Ying1, LIU Xiang-fu1, LIU Ling-ling2, LI Fang1, QIN Xue-ling1, LIN Dong-jun1, 2

(1DepartmentofBloodTransfusion,2DepartmentofHematology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:xiaolu1196@163.com；lindongjun0168@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the expression of aplasia rashomolog member I (ARHI) gene in acute myeloid leukemia cells (AML) and to study the effects of ARHI on the growth of AML cell line U937.METHODS: The mRNA expression of ARHI in AML cells, 293FT cells, AML primary cells and healthy volunteer blood cells were detected by RT-PCR. After transfection with the MSCV-IRES-GFP-ARHI plasmid to the U937 cells, the growth curve was analyzed by MTT assay. U937 cells were re-suspended by fresh medium and cultured for 24 h, then the cell cycle distribution and apoptotic rate were determined. RESULTS: The mRNA of ARHI was positively detectable in 293FT cells and healthy volunteer blood cells instead of AML cell line and AML primary cells. The growth curve showed that cell viability in U937 cells with high expression of ARHI (U937-ARHI) was lower than that in the control cells (U937-GFP) on 6th～8th day. The ratio of G2/M phase and apoptotic rate in the U937-ARHI cells were increased compare with control group(P<0.05). CONCLUSION: The mRNA level of ARHI is low in AML cells. High expression of ARHI gene in U937 cells inhibits cell growth, arrests the cells at G2/M phase and induces apoptosis.

[KEY WORDS]ARHIgene; Acute myeloid leukemia; Cell cycle; Apoptosis

急性白血病是一種來源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，其發病機制涉及到多種因素，其中抑癌基因的失活在白血病發生發展中起重要作用。抑癌基因又稱為腫瘤抑制基因，是一類能抑制細胞過度增殖、促進細胞分化從而抑制腫瘤形成的基因，它的丟失或失活可能導致腫瘤發生。目前已經發現多種抑癌基因包括P53、P16、P73、RUNX3等均與白血病的發病有關[1-4]。

ARHI基因定位于人染色體1p31，總長大約8 kb，其中包括2個外顯子，1個內含子。ARHI為Ras超家族成員之一，屬于小GTP結合蛋白，與Ras、Rap基因有著50%～60%的同源性，但是Ras/Rap家族均存在效應區YDPTIEDSY，而ARHI則擁有獨特的基序YLPTIENTY[5]。ARHI基因最早是在1999年由Yu等[6]從卵巢和乳腺上皮細胞及其癌細胞中克隆而來，與大部分Ras超家族成員不同的是,ARHI表現為抑癌基因，目前研究較多的是其在實體腫瘤中的作用，ARHI基因表達缺失與腫瘤進展以及不良預后相關[7-8]。然而ARHI在白血病細胞中的作用尚未見相關報道，本實驗將探索ARHI在急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的表達情況及其對細胞生長的影響。

材料和方法

1試劑與儀器

RPMI-1640培養基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青公司；構建載體所用的酶包括高保真DNA聚合酶、BglII 限制性內切酶、SalI 限制性內切酶、T4 DNA連接酶以及Taq DNA聚合酶均購自TaKaRa；反轉錄試劑盒以及RT-PCR反應試劑盒購自Thermo；MTT、碘化丙啶以及RNase A購自Sigma。細胞培養箱、PCR儀以及酶標儀購自Bio-Rad；熒光倒置顯微鏡購自Olympus；流式細胞儀購自BD。

2細胞培養

U937細胞、293FT 細胞為中山大學附屬第三醫院血液實驗室保存細胞；AML原代細胞取自本院血液科患者的骨髓；正常外周血標本取自健康志愿者。U937為懸浮細胞，接種于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中傳代培養，2～3 d換液1次。293FT 細胞系為貼壁細胞，培養于含有 10% 四季青血清的 DMEM 培養基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養，2 d傳代1次。

3方法

3.1全長基因的擴增查找GenBank里ARHI基因的編碼序列，mRNA開放編碼閱讀框ORF：其編碼氨基酸的CDS為295～985。設計引物擴增編碼蛋白質序列基因全長。上游引物序列為5’-CCAGATCTATGGGTAACGCCAGCTTTGGCT-3’，下游引物序列為5’-GGCCCGTCGACTCACATGATTATGCACTTG-3’，酶切位點前面設置保護堿基。

3.2反轉錄及RT-PCR利用 TRIzol 法提取白血病細胞株以及原代細胞的RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成 cDNA。然后利用PCR擴增ARHI基因(690 bp)。 反應條件為95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環;72 ℃延伸 10 min。

3.3MSCV-IRES-GFP-ARHI載體的構建雙酶切PCR產物和MSCV-IRES-GFP質粒，酶連反應獲取目的質粒，通過轉化、挑克隆以及搖菌擴增質粒。

3.4構建穩定高表達ARHI的細胞株提取MSCV-IRES-GFP-ARHI 重組載體質粒，pKat質粒以及pVSV-G質粒。將293FT 細胞以適宜的密度接種于培養皿中。待細胞密度達90%左右時進行包裝；利用Lipofectamine 2000將上述3種質粒以一定比例混合共轉染293FT 細胞；16～18 h 后換為新鮮培養基；24和48 h后分別收集上清。感染U937細胞，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光細胞；繼續培養至細胞數達到1×107/L，進行流式分選出帶GFP的細胞。轉染了MSCV-IRES-GFP的細胞簡稱為U937-GFP細胞，轉染了MSCV-IRES-GFP-ARHI的細胞簡稱為U937-ARHI細胞。

3.5細胞生長曲線測定取生長良好的細胞，用新鮮培養基制成細胞懸液，接種于96孔板，每孔的細胞為500個。24 h 后用MTT法檢測活細胞數，設5個復孔，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，細胞培養4 h，加DMSO后，用酶標儀在490 nm波長處檢測。以后每隔24 h 檢測1次，連續計數 8 d，然后繪制生長曲線。

3.6細胞周期檢測采用流式細胞術檢測細胞周期，將U937-GFP和U937-ARHI細胞用新鮮培養基重懸后接種于6孔板，每孔細胞數為5×105/L，每種細胞設置3個復孔，培養24 h后收集細胞，用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法測定細胞周期。

4統計學處理

SPSS 16.0軟件進行統計學分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間的比較用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1白血病細胞中ARHI mRNA的表達水平

本研究用RT-PCR法檢測人胚腎細胞293FT以及AML細胞株U937、HL-60、NB4中的ARHI mRNA表達情況，瓊脂糖電泳結果顯示293FT細胞有ARHI mRNA的表達，HL-60、U937以及NB4 3種AML細胞株中未檢測到ARHI mRNA表達；此外，3例AML患者的血標本也未檢測到ARHI mRNA表達，而在志愿者血細胞中有表達，見圖1、表1。結果提示ARHI基因表達可能與白血病發病有關，因此本研究構建了高表達ARHI的U937細胞株，觀察此基因對白血病細胞生長的影響。

Figure 1.The mRNA level of ARHI in 293FT cells, leukemia cell lines, AML primary cells and healthy volunteer blood cells. H: healthy volunteer blood cells; P: AML primary cells.

圖1293FT細胞、白血病細胞株、AML原代白血病細胞以及健康志愿者外周血中ARHI mRNA的表達情況

表1　患者的一般資料

2MSCV-IRES-GFP-ARHI質粒的驗證

利用BglⅡ以及SalⅠ雙酶切質粒，瓊脂糖跑膠可見620 bp的ARHI基因以及MSCV-IRES-GFP載體。同時對目的基因進行完整測序，使用 Blast 軟件進行序列比對，驗證結果相符,見圖2。

Figure 2.ARHIwas linked to MSCV-IRES-GFP plasmid.

圖2雙酶切驗證ARHI連接至MSCV-IRES-GFP載體

3穩定高表達ARHI的U937細胞株的鑒定

經慢病毒感染的U937細胞，進行流式細胞儀分選出帶GFP 細胞。在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光細胞(圖3)；提取U937-GFP、U937-ARHI細胞總 RNA，反轉錄后進行RT-PCR 檢測，可見U937-ARHI細胞高表達ARHI基因(圖4)。

Figure 3.Images of U937 cells infected with MSCV-IRES-GFP or MSCV-IRES-GFP-ARHI under fluorescence microscope (×200).

圖3慢病毒轉染的U937細胞中可見綠色熒光

Figure 4.The mRNA level of ARHI in U937-GFP cells and U937-ARHI cells.

圖4U937-GFP和U937-ARHI細胞中ARHI mRNA的表達水平

4細胞的生長曲線

將U937-GFP細胞和U937-ARHI細胞培養8 d，每天用MTT法檢測細胞活性，結果如圖5所示，第1～5天2種細胞活性相似，然而第6～8天，U937-GFP的細胞活性明顯高于U937-ARHI細胞(P<0.05)。

Figure 5.The growth curve of U937-GFP cells and U937-ARHI cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsU937-GFP.

圖5U937-GFP細胞以及U937-ARHI細胞的生長曲線

5細胞周期檢測

相同數量的U937-GFP細胞和U937-ARHI細胞經新鮮培養基重懸，在6孔板培養24 h后用流式細胞術測定其細胞周期，結果顯示U937-ARHI細胞G2/M期的比例高于U937-GFP，說明ARHI基因可以使細胞阻滯在G2/M期，另外，U937-ARHI細胞的凋亡率高于U937-GFP細胞,見圖6、表2。

Figure 6.The cell cycle distribution of U937-GFP cells and U937-ARHI cells. Mean±SD.n=3.

圖6U937-GFP和U937-ARHI的細胞周期及凋亡

表2　U937-GFP和U937-ARHI細胞的周期以及凋亡率

*P<0.05vsU937-GFP.

討論

ARHI又名DIRAS3、NOEY2基因，是1999年發現的母源性印跡抑癌基因。基因印跡是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時發生了修飾，使帶有親代印跡的等位基因具有不同的表達特性，表現為僅一方親本來源的同源基因表達，而來自另一親本的不表達。在正常細胞中，母源性的ARHI等位基因上發生CpG島甲基化修飾，使其轉錄活性受到抑制，而父源性的等位基因不受修飾，從而能夠在子代中表達[9]。

自1999年美國德克薩斯大學Andesron癌癥中心的科研團隊發現ARHI基因后，其生物學功能以及與腫瘤的關系得到廣泛研究，研究最多的是其在卵巢癌以及乳腺癌中的作用。ARHI在人體多種組織中均有表達，其中正常卵巢的表達最高[6]，在正常卵巢組織中ARHI mRNA 表達率為100%，在卵巢癌組織中表達水平下調，Yu等[6]科研團隊利用實時熒光定量PCR的方法對40例卵巢癌患者手術組織標本進行研究發現ARHI基因表達缺失率達88%[10]。此外，研究發現ARHI基因表達缺失還與卵巢癌瘤進展以及不良預后相關[8]。同樣，在正常乳腺組織中均存在ARHI mRNA表達，而乳腺癌組織中表達下調或缺失，提示ARHI在乳腺癌發病過程中起重要作用[11]。近年來陸續有研究發現，ARHI在其它實體腫瘤中也存在異常表達，Yang等[12]研究發現在正常胰腺組織中，ARHI表達位于導管上皮，腺泡細胞和胰島細胞在胰腺癌組織中表達缺失率為50%。另外，在肝癌、胃癌、甲狀腺癌等腫瘤中也發現ARHI的作用[13-15]。

ARHI在實體腫瘤中的研究報道顯示其對腫瘤的發生發展起著重要作用，那么其在血液系統腫瘤中的作用如何呢，本研究首先用RT-PCR法檢測了ARHI mRNA在正常上皮細胞株293FT以及AML細胞株中的表達情況，結果顯示在293FT細胞中可檢測到ARHI，而在U937、HL-60、NB4中未檢測到它的表達。此外，本研究比較了健康志愿者以及AML患者外周血標本中ARHI mRNA的表達情況，3例志愿者的血標本中可檢測到ARHI mRNA，而AML原代細胞中并無表達，由于樣本量少，本文沒法做出準確的統計分析，但是這個結果提示了ARHI基因在白血病原代細胞中表達減少，這和實體腫瘤的結果是一致的[10-11]。

發現ARHI基因在白血病細胞中表達減少后，本研究進一步觀察了此基因對白血病發病以及發展的可能影響。目前已經發現的ARHI基因主要有以下生物學功能。(1)抑制細胞增殖：Xu等[16]在2000年建立一個高表達ARHI的轉基因鼠模型，發現子代鼠的體重明顯低于正常鼠，且子代鼠體重降低程度與ARHI基因表達水平相關，說明該基因在鼠科動物的生長發育過程中是一個負性調控因子。進一步研究發現高表達ARHI的轉基因鼠體重降低與泌乳素水平降低有關。除了正常細胞外，研究發現ARHI基因能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，包括卵巢癌[5]、乳腺癌[17]、胰腺癌[18]等。(2)參與調控細胞周期：細胞周期是指連續分裂的細胞，從一次完成分裂開始，到下一次完成分裂為止的過程。一般分為分裂間期和分裂期2個階段。用流式細胞儀檢測細胞周期分裂期分為G1、S、G2/M 3個階段。研究發現ARHI基因可以使不同的腫瘤細胞阻滯在不同的細胞周期。在胰腺癌細胞中的過表達ARHI可誘導G1期細胞周期阻滯，其機制為磷酸化蛋白激酶Akt水平降低導致P53蛋白積聚，從而上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21WAF1使細胞周期阻滯在G1[17]。另有研究表明高表達ARHI基因可以使卵巢癌細胞SKOV3阻滯在S期，其機制可能與磷酸化信號轉導及轉錄激活因子以及磷酸化細胞外調節蛋白激酶水平降低有關[18]。此外DNA 去甲基化試劑和/或組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以在卵巢癌 Hey 和 SKOv3 中誘導ARHI表達而造成G2/M 期阻滯[19]。(3)促進細胞凋亡：有研究發現將高表達ARHI基因腺病毒載體的液體注射到無ARHI表達的裸鼠乳腺癌及卵巢癌模型中，發現部分乳腺癌以及卵巢癌出現明顯的細胞凋亡，進一步研究發現其機制可能與calpain蛋白酶和鈣蛋白酶介導的凋亡信號轉導有關[20]。在胰腺癌細胞系中再表達ARHI基因后，凋亡細胞比例增加，此作用與ARHI基因下調NF-κB通路有關[21]。(4)誘導細胞自噬：有研究發現ARHI是一個新的能調控細胞自噬的基因，其能夠誘導細胞自噬[22]。

基于以上ARHI的生物學功能，本研究檢測了該基因對AML細胞的生長、細胞周期以及細胞凋亡的影響。實驗構建了高表達ARHI基因的U937細胞株(U937-ARHI)，連續8 d檢測了細胞的生長情況，結果顯示，在生長曲線的前期2組細胞的活性相似，然而至生長曲線的后期(6～8 d)，U937 -ARHI細胞活性低于U937-GFP細胞，兩者差異有統計學意義，說明ARHI基因能夠抑制U937的生長，此結果與該基因在實體腫瘤中的作用一致[5, 17]。進一步的實驗發現ARHI基因可以使U937細胞阻滯在G2/M期從而影響細胞的有絲分裂。凋亡相關檢測也表明轉染了ARHI基因的U937細胞的凋亡率大于對照組細胞。從凋亡率的數值分析看，U937-GFP細胞的基礎凋亡率非常低，僅為0.02%，在轉染了ARHI基因后，雖然凋亡率大大增加到1.19%，但是數量仍然很低，這也解釋了為什么生長曲線中前5天2種的細胞活性無差異，直至第6天當凋亡以及周期阻滯的細胞積累到一定數量后，兩者才出現活性細胞數量的差異。

本研究觀察了ARHI在AML細胞中的表達情況，結果表明，ARHI mRNA在白血病細胞中的表達少于正常細胞，進一步構建高表達ARHI的U937細胞發現，ARHI能夠抑制白血病細胞的生長，其作用機制可能與其阻滯細胞周期在G2/M期以及促進細胞凋亡有關。下一步的實驗將收集更多的急性白血病原代細胞標本，檢測ARHI mRNA和ARHI蛋白的表達情況，做更進一步的統計分析，在此基礎上，研究ARHI在白血病細胞中表達減少的可能原因。根據ARHI在實體腫瘤中的研究報道，ARHI基因失活的原因主要為雜合性缺失以及甲基化。ARHI是一種印跡基因，雖然其母源性等位基因不表達，但其父源性等位基因能夠轉錄、翻譯出具有正常功能的蛋白質。乳腺癌以及卵巢癌細胞中均存在ARHI父源性等位基因的雜合性缺失[23]。抑癌基因甲基化在腫瘤中多有報道，本課題組既往的研究亦發現RUNX3基因、p53基因在白血病中存在甲基化現象[4,24]。ARHI是新近發現的新的抑癌基因，其啟動子區域存在2個CpG島，CpG島I和II，第3個CpG島位于蛋白編碼區域[25]。在卵巢癌、乳腺癌以及胰腺癌等腫瘤中均發現有ARHI基因的甲基化[18, 26]。 如果其在白血病細胞中也存在基因甲基化現象，那么ARHI基因將成為去甲基化藥物治療白血病的又一作用靶點。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)