丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病患者TLR4炎癥信號通路及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

·論著·

丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病患者TLR4炎癥信號通路及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響

徐濤張哲王錦鵬田豐永劉欣

項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局課題(編號：2015031)

作者單位： 075000河北省張家口市，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院(徐濤)；河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張哲)，功能科(劉欣)；河北省滄縣醫(yī)院(王錦鵬、田豐永)

E-mail：13582029996@163.com

【摘要】目的觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病患者TLR4炎癥信號通路及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響，以TLR4炎癥信號通路為靶點(diǎn)探討丹參酮ⅡA磺酸鈉治療冠心病的可能機(jī)制。方法選取2014年1月至2015年1月診治的冠心病患者160例，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組80例。對照組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予阿托伐他汀治療，觀察組在對照組基礎(chǔ)上加用丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，療程為30 d。采用Real time-PCR測定外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定血清白介素-6(IL-6)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬白酶-9(MMP-9)及抗氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)抗體水平。流式細(xì)胞儀測定外周血淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo))變化。免疫比濁法測定免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)及補(bǔ)體C3、C4水平。結(jié)果與治療前比較，治療后2組TLR4 mRNA、IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9、ox-LDL、IgA、IgG、IgM、C3、C4水平顯著降低水平顯著升高(P<0.05)，但觀察組上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于對照組(P<0.05)。結(jié)論丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀能抑制外周血TLR4 mRNA炎癥信號通路的激活，并改善機(jī)體免疫功能紊亂，這可能是丹參酮ⅡA磺酸鈉發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】丹參酮ⅡA磺酸鈉；阿托伐他汀；冠心病；Toll樣受體4；免疫功能

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.22.001

通訊作者：劉欣，050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院功能科；

【中圖分類號】R 541.4【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

收稿日期：(2015-04-29)

Effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate combined with atorvastatin on TLR4 inflammatory signal pathway and immune function of patients with coronary heart diseasesXUTao*,ZHANGZhe,WANGJinpeng,etal.*TheFirstHospitalofNorthCollege,Hebei,Zhangjiakou050051,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of sodium tanshinone ⅡA sulfonate combined with atorvastatin on TLR4 inflammatory signal pathway and immune function of patients with coronary heart diseases (CHD) in order to explore the possible action mechanism of sodium tanshinone ⅡA sulfonate in treatment of CHD.MethodsOne hundred and sixty patients with coronary artery diseases who were admitted into our hospital from January 2014 to January 2015 were randomly divided into observation group (n=80) and control group (n=80). The patients in control group were treated with atorvastatin,on the basis of symptomatic treatment,however, the other patients in observation group, on the basis of the control group, were treated with sodium tanshinone ⅡA sulfonate,with a treatment course of 30 days for both groups. The expression levels of TLR4 mRNA in peripheral blood were detected by Real time-PCR. The serum levels of IL-6, hs-CRP, TNF-α, MMP-9 and ox-LDL were measured by ELISA.by ELISA．The lymphocyte subsets) were detected by flow cytometry. The immunoglobulins (IgA, IgG, IgM) and complement levels (C3,C4) were examined by turbidimetric inhibition immuno assay for both groups.Results As compared with those before treatment，the levels of TLR4 mRNA，IL-6，hs-CRP，TNF-α，MMP-9，ox-LDL，IgA，IgG，IgM，C3，C4 were significantly decreased after treatment for both groups (P<0.05)，however，the levels of were significantly increased (P<0.05),moreover,the observation group was superior to control group in the improvement degree of these indexes (P<0.05).ConclusionSodium tanshinone ⅡA sulfonate combined with atorvastatin can significantly inhibit the activation of TLR4 inflammatory signal transduction pathway and can improve immunological function disorders,which may be one of the action mechanisms of sodium tanshinone ⅡA sulfonate in treatment of CHD.

【Key words】sodium tanshinone ⅡA sulfonate; atorvastatin; coronary artery diseases; TLR4;immune function

冠心病是嚴(yán)重危害中老年人群健康的心血管疾病之一，其病理機(jī)制是在冠狀動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上局部血栓形成造成冠脈血流下降，最終導(dǎo)致心肌缺血和實(shí)質(zhì)性損傷[1]。研究顯示，細(xì)胞免疫、體液免疫、補(bǔ)體系統(tǒng)及細(xì)胞因子均與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，這一過程貫穿動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始末。因此，免疫炎癥損傷是動脈粥樣硬化的主要病理機(jī)制之一[2，3]。本研究以TLR4炎癥信號通路為切入點(diǎn)，通過觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀對冠心病患者免疫炎性反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的影響，旨在探討丹參酮ⅡA磺酸鈉治療冠心病的可能機(jī)制，為丹參酮ⅡA磺酸鈉在冠心病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年1月河北省人民醫(yī)院心內(nèi)科收治的冠心病患者160例。所有患者均經(jīng)臨床癥狀、冠脈造影、心電圖檢查確診為冠心病。160例患者隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組80例。2組年齡、性別比、病程等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　2組一般資料比較　n=80

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會制定的《冠心病診治指南(2011版)》；②患者簽署知情同意書；③經(jīng)皮冠脈支架形成術(shù)治療效果良好者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤患者；②嚴(yán)重心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者；③血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病患者；④經(jīng)皮冠脈支架治療失敗者；⑤有他汀類藥物過敏史者；⑥有精神疾病病史者。

1.3治療方法2組均給予吸氧、硝酸酯類、鈣拮抗劑、β受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、阿司匹林等常規(guī)治療，并給予低脂飲食。對照組給予口服阿托伐他汀片(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)，10 mg/d，1次/d。觀察組在對照組基礎(chǔ)上給予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)，80 mg加入到250 ml 5%葡萄糖注射液中，靜脈滴注，1次/d。療程均為30 d。

1.5檢測方法

1.5.1Real time-PCR:根據(jù)GeneBank中人TLR4 mRNA序列，采用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2，由日本Takara生物技術(shù)有限公司合成。Trizol提取外周血單個核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量RNA的純度和濃度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈。PCR反應(yīng)在ABI 7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增完畢后進(jìn)入儀器自帶的SDS v1.3軟件結(jié)果分析界面，使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值。設(shè)對照組樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，目的基因mRNA相對表達(dá)水平為2-△△Ct，設(shè)β-actin為內(nèi)參照基因。見表2。

表2　TLR4引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.5.2ELISA法:采用ELISA法測定血清IL-6、IL-8、hs-CRP、TNF-α及ox-LDL抗體水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。960酶標(biāo)儀購自美國Sigma公司。

1.5.4免疫比濁法:在全自動生化分析儀上采用免疫透射比濁法測定IgA、IgG、IgM、C3、C4水平。7080全自動生化分析儀購自日本日立公司。

2結(jié)果

2.12組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)比較治療前2組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后2組TLR4 mRNA表達(dá)均較治療前有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但觀察組降低程度更明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.22組血清炎性因子水平比較治療前2組血清IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后2組IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9水平均較治療前有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但觀察組降低程度更明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表32組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)比較

組別TLR4mRNA相對表達(dá)水平對照組 治療前4.8±0.8 治療后3.5±0.5*觀察組 治療前4.9±0.8 治療后2.3±0.4*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

表4　2組血清炎性因子水平比較　 ±s

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

表52組T淋巴細(xì)胞亞群比較

組別CD+3(%)CD+4(%)CD+8(%)CD+4/CD+8對照組 治療前49±8 24±3 12.6±2.01.68±0.22 治療后59±9*33±5*18.3±2.9*1.79±0.26*觀察組 治療前49±8 24±3 13.0±2.11.70±0.23 治療后72±9*#44±6*#23.4±3.2*#1.90±0.35*#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.42組免疫球蛋白、補(bǔ)體比較治療前2組IgA、IgG、IgM、C3、C4比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后2組IgA、IgG、IgM、C3、C4均較治療前有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但觀察組降低程度更明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表62組免疫球蛋白、補(bǔ)體比較

組別IgAIgGIgMC3C4對照組 治療前3.79±0.51 14.0±2.1 2.77±0.42 2.45±0.32 0.47±0.07 治療后2.82±0.42*11.2±1.8*2.01±0.26*1.32±0.23*0.34±0.04*觀察組 治療前3.82±0.56 13.9±2.0 2.80±0.43 2.49±0.35 0.48±0.06 治療后1.93±0.24*#7.5±1.1*#1.34±0.18*#0.73±0.12*#0.19±0.03*#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

2.52組抗ox-LDL抗體水平比較治療前2組抗ox-LDL抗體水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后兩組抗ox-LDL抗體水平均較治療前有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但觀察組降低程度更明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表72組抗ox-LDL抗體水平比較

組別抗ox-LDL抗體對照組 治療前174±24 治療后142±20*觀察組 治療前180±26 治療后98±14*#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

3討論

冠心病是好發(fā)于中老年人的常見心血管疾病之一，具有發(fā)病率和病死率高、易反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，若未采取及時(shí)有效的干預(yù)措施病情呈持續(xù)進(jìn)展，易導(dǎo)致心肌缺血壞死、心力衰竭，甚至猝死[4]。目前，臨床治療冠心病主要采取增加冠脈流量、抗凝、抑制血栓形成等治療措施，但療效不甚理想。因此，闡明冠心病的發(fā)病機(jī)制對于疾病治療具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，免疫炎性反應(yīng)貫穿動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始末，并且炎性因子可作為冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來，TLR4介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)在動脈粥樣硬化形成及冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視。TLR4是脂質(zhì)代謝紊亂、免疫炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多個病理過程中的橋梁，激活TLR4可通過多條信號級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致NF-κB激活和核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)hs-CRP、TNF-α等炎性因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘發(fā)慢性炎性反應(yīng)[5]。IL-6是炎性反應(yīng)中起核心作用的重要介質(zhì)，具有誘導(dǎo)血管活性物質(zhì)釋放、促進(jìn)凝血及血栓形成等多重生物學(xué)功能[6]。hs-CRP是反應(yīng)機(jī)體炎癥狀態(tài)的敏感指標(biāo)，可作為判斷斑塊穩(wěn)定性、疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的預(yù)測因子[7]。TNF-α由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞及促進(jìn)凝血、血栓形成等作用，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展[8]。MMP-9是MMPs家族的重要成員，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增高甚至破裂[9]。本研究結(jié)果顯示，觀察組治療后TLR4 mRNA、IL-6、hs-CRP、TNF-α、MMP-9水平顯著低于對照組(P<0.05)，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀能進(jìn)一步發(fā)揮抗炎作用，且這一作用與TLR4炎癥信號通路的抑制有關(guān)，與前人研究結(jié)果[10]一致。

綜上所述，丹參酮ⅡA磺酸鈉聯(lián)合阿托伐他汀能夠顯著抑制TLR4炎癥信號通路的激活及炎性因子的分泌和釋放，并改善機(jī)體免疫功能紊亂，這可能是丹參酮ⅡA磺酸鈉發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。

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·消息·

雜志稿件內(nèi)容的有關(guān)規(guī)范要求

1.當(dāng)報(bào)告以人為研究對象的試驗(yàn)時(shí)，作者應(yīng)該說明其遵循的程度是否符合負(fù)責(zé)人體試驗(yàn)的委員會(單位性的、地區(qū)性的或國家性的)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該委員會的批準(zhǔn)，是否取得受試對象的知情同意。

2.根據(jù)GB/T 7408-94《數(shù)據(jù)元和交換格式信息交換日期和時(shí)間表示法》，由特定起點(diǎn)與終點(diǎn)定界的時(shí)間段的表示，起點(diǎn)與終點(diǎn)之間以一字線為分隔符，而不再用波紋線。示例如下：2001—2004年，而不再表示為2001～2004年，但“—”也可以用“至”取代。注意：除了上述時(shí)間段之外的其他計(jì)數(shù)、計(jì)量范圍的表示，仍然用“～”，如2～8 kg。

3.根據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的全國高等學(xué)校教材《衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)》第5版，報(bào)告統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的結(jié)論時(shí)，對P值小于或等于檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(一般為0.05)的情況，一律描述為“差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義”，同時(shí)寫明P值的具體數(shù)值或相應(yīng)的不等式，不再采用將P<0.05描述為“差異有顯著意義(或差異有顯著性)”、將P<0.01描述為“差異有非常顯著意義(或差異有非常顯著性)”的表達(dá)方法。在用不等式表示P值的情況下，一般選用P>0.05、P<0.05和P<0.01三種表達(dá)方式即可滿足需要，無須再細(xì)分為P<0.001或P<0.0001。

4.為便于表格的排版和版式的美觀，表格中注釋用的角碼符號一律采用單個角碼的形式，按下列順序選用：*、#、△、☆、▲、★；在表注中依先縱后橫的順序依次標(biāo)出。

本刊編輯部