急性低血糖大鼠血清FT3、FT4、TSH水平及下丘腦組織TRH表達變化

屈丹，姜雅秋( 中國醫科大學附屬第一醫院內分泌與代謝病科，內分泌研究所，沈陽000;2本溪市中心醫院內分泌科)

急性低血糖大鼠血清FT3、FT4、TSH水平及下丘腦組織TRH表達變化

屈丹1，2，姜雅秋1
( 1中國醫科大學附屬第一醫院內分泌與代謝病科，內分泌研究所，沈陽110001;2本溪市中心醫院內分泌科)

摘要:目的觀察急性低血糖大鼠血清游離三碘甲狀腺原氨酸( FT3)、游離甲狀腺素( FT4)、促甲狀腺激素( TSH)水平及下丘腦組織促甲狀腺激素釋放激素( TRH)表達的變化。方法Wistar大鼠21只，根據血糖水平分為正常血糖組、輕度低血糖組、重度低血糖組3組，每組7只，后兩組腹腔注射短效胰島素誘導急性低血糖，輕度低血糖組血糖2.0～2.64 mmol/L，重度低血糖組血糖＜2.0 mmol/L。化學發光免疫法檢測各組大鼠血清FT3、FT4、TSH，Western blotting法、實時熒光定量PCR法分別檢測各組大鼠下丘腦組織中的TRH蛋白及mRNA。結果正常血糖組、輕度低血糖組、重度低血糖組FT3分別為( 5.05±1.40)、( 4.82±1.22)、( 4.92±1.08) pmol/L，FT4分別為( 2.45±0.26)、( 2.19±0.11)、( 2.30±0.21) pmol/L，TSH分別為( 0.16±0.10)、( 0.05±0.03)、( 0.04±0.04)μIU/mL，輕度低血糖組、重度低血糖組分別與正常血糖組FT4、TSH比較，P均＜0.05。正常血糖組、輕度低血糖組、重度低血糖組TRH蛋白分別為0.66±0.01、0.34±0.01、0.52± 0.07，TRH mRNA分別為1.44±0.10、0.54±0.04、2.42±0.97，輕度低血糖組、重度低血糖組分別與正常血糖組比較，輕度低血糖組與重度低血糖組比較，P均＜0.05。結論急性低血糖大鼠血清FT4、TSH水平降低，FT3不變，下丘腦組織中TRH蛋白表達降低，TRH mRNA表達先降低后升高。

關鍵詞:應激反應;低血糖;游離三碘甲狀腺原氨酸;游離甲狀腺素;促甲狀腺激素;促甲狀腺激素釋放激素

應激是一種機體多系統共同參與的全身性適應反應，在應激原的刺激下，機體過度分泌或抑制相關應激激素。在創傷應激相關激素中最有特異性的指標為皮質醇和甲狀腺激素，兩者具有對應激后機體的保護作用。急性低血糖作為一種急性應激狀態，在低血糖發生時，下丘腦的“糖感受器”將信息迅速傳遞到相關神經元，引起下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素( CRH)細胞興奮，同時表達促甲狀腺激素釋放激素( TRH)。本研究觀察了急性低血糖大鼠血清游離三碘甲狀腺原氨酸( FT3)、游離甲狀腺素( FT4)、促甲狀腺激素( TSH)水平及下丘腦組織TRH表達的變化。

1　材料與方法

1.1動物與試劑3～8周齡SPF級Wistar雄性大鼠21只，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物中心。FT3、FT4、TSH采用西門子DPC Immulite 2000型自動發光免疫分析儀檢測，TRIzol購自大連寶生物公司，逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司，TRH及β-actin引物購自大連寶生物公司，TRH一抗購自北京博奧森生物有限公司。

1.2實驗動物分組及處理根據血糖水平分為正常血糖［1］組、輕度低血糖組、重度低血糖組3組，每組7只。后兩組采用胰島素腹腔注射誘導大鼠低血糖的方法［2］，腹腔注射短效胰島素(生物合成人胰島素，諾和諾德公司，50 U/kg)。以微型血糖儀(德國羅康全)斷尾法測量血糖，并記錄所有大鼠腹腔注射胰島素后每隔30 min的血糖值，直至達到目標血糖。輕度低血糖組血糖2.0～2.64 mmol/L，大鼠興奮、身體發抖、四處覓食;重度低血糖組血糖＜2.0 mmol/L，大鼠神志恍惚甚至全身抽搐。大鼠稱體質量，10%水合氯醛腹腔麻醉后，上腹正中切口，游離肋骨，心臟采血，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，存入Eppendorf管中，－80℃冰箱中保存。大鼠經心臟采血后，斷頭，3 min內取腦，分離腦組織后迅速置于－40℃干冰異戊烷中30 s，快速冷凍腦組織，后于－80℃冰箱凍存。

1.3各組大鼠血清FT3、FT4、TSH檢測采用化學發光免疫法，按照西門子DPC Immulite 2000型自動發光免疫分析儀標準操作規程操作。

1.4各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白檢測采用Western blotting法。組織裂解液裂解下丘腦組織，

12 000 r/min離心5 min，取上清，測定總蛋白含量。已溶解于加樣緩沖液的總蛋白質經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V電泳轉移至硝酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉液封閉2 h，用1∶100稀釋TRH抗體(兔抗鼠多克隆抗體，北京博奧森公司)進行Western蛋白印跡雜交，40℃孵育過夜。1∶400稀釋的二抗孵育2 h，采用DAB顯色試劑盒顯影并檢測。以β-actin作為內對照。

1.5各組大鼠下丘腦組織TRH mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。按照Paxinos-Watson的大鼠腦立體定位圖譜，取下丘腦組織50～100 mg，用TRIzol法提取總RNA，取1 μg總RNA用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行逆轉錄反應得到cDNA，再用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時熒光定量PCR反應。GLP-1R上游引物: 5'-CGACCCTGGATTCGGGAGTA-3'，下游引物: 5'-AGGCGCAGGATTCAGGGATA-3'，產物長度145 bp; GAPDH的上游引物: 5'-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物: 5'-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3'，產物長度123 bp，反應體系25 μL，逆轉錄反應條件: 37℃15 min，85℃5 s; PCR反應條件: 95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40次; PCR反應結束后，分析DNA擴增曲線，使用專用數據處理軟件獲取數據，以2－ΔΔCt代表目的基因mRNA的相對表達量。

1.6統計學方法采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用Cruskal Wallis分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較見表1。各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白、mRNA表達比較見表2。

表1　各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較(±s)

表1　各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較(±s)

注:與正常血糖組比較，ΔP＜0.05。

組別　FT3( pmol/L)　 FT4( pmol/L)　 TSH(μIU/mL)正常血糖組5.05±1.40　 2.45±0.26　 0.16±0.10輕度低血糖組　4.82±1.22　 2.19±0.11Δ　0.05±0.03Δ重度低血糖組　4.92±1.08　 2.30±0.21Δ　0.04±0.04Δ

表2　各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白、mRNA表達比較(±s)

表2　各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白、mRNA表達比較(±s)

注:與正常血糖組比較，ΔP＜0.05;與輕度低血糖組比較，▲P＜0.05。

組別　TRH蛋白TRH mRNA正常血糖組0.66±0.01　1.44±0.10輕度低血糖組　0.34±0.01Δ　0.54±0.04Δ重度低血糖組　0.52±0.07Δ▲　2.42±0.97Δ▲

3　討論

下丘腦-垂體-甲狀腺軸的活性在能量平衡中至關重要，對身體和心理應激起著不同的調節作用。既往關于應激時甲狀腺軸改變報道不一，曾有報道顯示運動、焦慮、明暗交替等應激時甲狀腺軸會被抑制［3］，可能是通過降低代謝而保存能量。饑餓時人類T3、T4、TSH降低，低甲狀腺素水平無法激發TRH產生增多。在饑餓的嚙齒類動物中，除了甲狀腺激素水平降低外，還觀察到釋放到垂體門脈系統的TRH減少，TRH mRNA水平降低。外科手術或重癥創傷等應激刺激可引起生長抑素的分泌，使TSH釋放減少，T3、T4分泌減少，以減少機體的代謝消耗。大鼠慢性不可預見應激可引起T3、T4下降，并能干擾下丘腦-垂體-甲狀腺軸的日節律［4］。Uribe等［5］發現Wistar大鼠下丘腦室旁核TRH mRNA和TSH下降后，垂體前葉TRHR1 mRNA水平升高，血甲狀腺激素水平不變。TRH神經元接受中樞神經系統其他部位的調控，這些部位的神經元將環境刺激與TRH神經元網絡起來，并借TRH神經元與腺垂體建立神經-體液調節聯系。例如寒冷刺激的信息傳遞到中樞神經系統后，一方面再傳遞到下丘腦的體溫調節中樞，另一方面又立即傳遞到附近的TRH神經元，使TRH分泌增多，進而增加TSH的分泌，血T3、T4隨之升高。

危重疾病時由于組織損害及內環境嚴重失調，應激可以使甲狀腺激素代謝途徑改變，血清T3、T4水平發生變化，這種臨床現象被稱為非甲狀腺疾病綜合征，又稱低T3綜合征或甲狀腺功能正常病態綜合征，幾乎在所有的急性或慢性非甲狀腺疾病患者都會發生［6～8］。循環中T3的分泌有20%來自于甲狀腺，由肝細胞的Ⅰ型碘化甲狀腺原氨酸5'-脫碘酶對T4的轉化而來。非甲狀腺疾病綜合征時肝臟中該酶作用障礙，使得血清T3水平降低，血清反T3水平升高。低水平的T3反過來會進一步減少5'-脫碘酶的產生，最終導致血漿T3濃度呈螺旋式下降［8］。與此同時，TSH的水平通常保持在正常范圍內，或僅有輕度增加。約50%非甲狀腺疾病綜合征患者也會出現TSH水平下降，提示這種伴隨情況可能來自下丘腦/垂體的調控［9］。引起這些變化的機制仍存在爭議，可能是應激狀態下機體降低新陳代謝率的適應性調節，或是某種潛在生理調控過程的結果。

本研究發現，急性低血糖時大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸表現為血清FT4、TSH降低，FT3不變，下丘腦組織中TRH蛋白表達降低，TRH mRNA表達先降低后升高。可見急性低血糖作為一種急性應激狀態，下丘腦-垂體-甲狀腺軸此時處于被抑制狀態。既往曾有日本學者報道給予胰島素時會引起下丘腦TRH先降低后升高，從而刺激TSH分泌增多，T3增多。這是

胰島素對下丘腦的作用，還是急性低血糖對下丘腦的作用，還有待于進一步探討。中樞對低血糖的調控有重要作用，嚴重低血糖的發生主要原因在于中樞對低血糖的拮抗調節系統沒有被激活，因此尋找這種中樞不能有效啟動拮抗調節的機制就十分重要。而感知低血糖的特殊神經元分布在門靜脈和腦。血糖感受神經元能感受到其所處環境中血糖的變化，并且相應地改變其代謝率。在大腦皮質下區分布著更高級的血糖感受調控系統，其對低血糖發出應激信號，產生對低血糖的神經內分泌負調節反應( CRR)。對低血糖的CRR包括興奮交感神經，刺激高血糖素的分泌及影響下丘腦垂體腎上腺軸。這些產生應激信號的皮質下區通過神經纖維和下丘腦等部位聯系，應激時通過各系統共同作用維持機體能量平衡。在下丘腦中，神經元的肽類激素組成各種不同功能的調節環路。CRH和TRH組成的環路主要是調節熱能生產和應激反應。TRH還是瘦素/神經肽的食欲和體質量調節環路中的成員，參與食欲、攝食、飽感、體質量和熱能生成的中樞調節。因此，TRH在中樞對低血糖的調控方面可能發揮一定的作用。

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收稿日期:( 2015-04-27)

通信作者:姜雅秋

基金項目:遼寧省科學技術計劃重大、重點項目( 2012225021)。

文章編號:1002-266X( 2015)31-0030-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R363.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.011