傷科接骨片對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響

章 黎高建莉張 樺李召東

傷科接骨片對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響

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目的觀察傷科接骨片對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響。方法取BALB/c小鼠30只，隨機分為藥物+細胞組：傷科接骨片及飼料喂養+MC3T3-E1+明膠海綿；細胞組：單純飼料+ MC3T3-E1+明膠海綿；陰性對照組：單純飼料+生理鹽水+明膠海綿。每組10只。在小鼠右側股部臀大肌下方制成肌袋，藥物+細胞組和細胞組用無菌明膠海綿吸附MC3T3-E1細胞懸液、陰性對照組用無菌明膠海綿吸附生理鹽水后植入肌袋內。術后3天，藥物+細胞組將傷科接骨片（0.35g/片）用蒸餾水配制成濃度為20mg/mL的混懸液，按2.0mg/（g·d）劑量灌胃給藥，細胞組和對照組均灌胃給予2.0mg/（g·d）的蒸餾水。分別于建模后第4、8周每組各處死小鼠5只，取材后分別作大體、切片HE染色光鏡，以及掃描電鏡下觀察。結果 術后4周，藥物+細胞組和細胞組肌袋內均可見新骨出現，術后8周兩組均形成松質骨樣結構的板層骨，藥物+細胞組形成的板層骨結構較細胞組更為成熟，成骨細胞數量更多，膠原纖維分泌量也更多，并有更多的鈣化結節形成。陰性對照組內未見有明顯骨化現象。結論傷科接骨片可以促進MC3T3-E1細胞在動物體內的成骨作用。

小鼠；傷科接骨片；MC3T3-E1細胞；成骨能力

傷科接骨片是由海星、雞骨、三七、血竭、紅花等組成的純中藥制劑，主要功效活血化瘀，促進骨折愈合等。已有研究[1]從組織學和生物力學等方面證實，該藥能明顯改善血液循環，促進血腫機化，并促進骨痂鈣化等作用。但到目前為止，該制劑對成骨細胞在體內的作用仍不甚明了。為此，本實驗擬通過觀察傷科接骨片干預小鼠體內MC3T3-E1細胞的成骨作用，探討其促進骨折愈合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡BALB/c小鼠30只（許可證號：SCXK（京）2012-0001，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供），雌雄各半，體質量為22～26g。飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心普通級動物房（動物飼養合格證號為SCXK（浙）2013-0184），定時投放食水，做好標記，每周復稱體質量，實驗室溫度為16-25℃，濕度為40%～80%。

1.2 主要材料 傷科接骨片（藥物組成：海星、雞骨、三七、血竭、紅花等，大連美羅中藥廠有限公司，0.35g/片，批號201410389）。MC3T3-E1細胞（中科院上海細胞庫提供），取MC3T3-E1細胞株解凍復蘇后培養，當細胞長滿約90%后用0.25%胰酶消化制成1×105/L的細胞懸液。地塞米松（Sigma公司）、高糖DMEM（Biogen Idec公司）、胎牛血清（Biogen Idec公司）、抗壞血酸（Sigma公司）、0.25%胰酶（Biogen Idec公司）、β-磷酸甘油鈉（Sigma公司）等。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（Thermo，SW-CJ-2FD，美國）、低速離心機（Beckman，美國）、細胞培養箱（Forma，美國）、流式細胞儀（Moflo，Beckman Coulter）、倒置顯微鏡（Olympus，日本）、相差顯微鏡（Olympus）、照相機（Toshiba，日本）、熒光顯微鏡（Olympus）、數碼相機（Olympus）、石蠟切片機（Leca，德國）、XL-30環境掃描電子顯微鏡（Philips，荷蘭）、干燥儀（Abbott,LDM150D，美國）、HCP-2離子濺射儀（Hitachi，日本）等。

1.4 動物分組和模型構建 30只實驗小鼠隨機分為三組，每組10只：（1）藥物+細胞組：傷科接骨片及飼料喂養+MC3T3-E1+明膠海綿；（2）細胞組：單純飼料喂養+MC3T3-E1+明膠海綿；（3）陰性對照組：單純飼料喂養+生理鹽水+明膠海綿。三組均經腹腔內注射0.25mL濃度為6g/L的戊巴比妥鈉麻醉，按文獻方法[2]于每只小鼠右側股部臀大肌下方作一1.0cm的皮膚切口，切開皮膚及皮下組織，暴露肌肉組織，肌間隙內以止血鉗鈍性分離制成肌袋，然后將0.5cm×2.0cm×2.0cm大小的無菌明膠海綿折疊后吸附2mL的1×105/L MC3T3-E1細胞懸液（藥物+細胞組和細胞組），或者2mL生理鹽水（陰性對照組）植入所制作的肌袋內。逐層縫合切口，常規肌肉注射慶大霉素（4萬U/次，1天1次，3天）預防感染。術后將小鼠分籠飼養，每組均給予常規飼料喂養。3天后藥物+細胞組將傷科接骨片（0.35g/片）用蒸餾水配制成濃度為20mg/mL的混懸液，按2.0mg/（g·d）的劑量灌胃給藥，細胞組和對照組均灌胃2.0mg/（g·d）的蒸餾水。各組每日灌胃給藥1次，共8周。

1.5 取材及觀察 建模4、8周，各組隨機取小鼠各5只麻醉后斷頸處死，取肌袋內實驗材料后大體觀察。取部分組織雙醛固定（2%多聚甲醛+2.5%戊二醛）12h，10%EDTA脫鈣，常規組織學石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。剩余部分組織立即放入2%戊二醛中固定2h以上，去除固定劑，用PBS漂洗2次，每次10min，再用1%餓酸固定1h，PBS清洗3遍，乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥脫水，表面噴金后掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 大體觀察 建模后4周各組所取材料可見明膠海綿均大部分被降解，藥物+細胞組和細胞組均見板層骨生成，但前者周圍肌肉內部的硬化現象更為明顯。陰性對照組的肌袋內除殘留部分明膠海綿外，未見明顯成骨現象。8周后，各組肌袋中明膠海綿均被降解完全。藥物+細胞組和細胞組所生成的板層骨組已更為成熟，并可見骨髓樣組織存在于板層間的髓腔內，肌袋周圍可見骨化的肌肉并與肌袋內骨相連。而陰性對照組未見明顯骨化現象。

2.2 光鏡觀察 光鏡下觀察，建模后4周可見藥物+細胞組較細胞組所形成新骨量多，但骨組織結構尚不成熟，板層骨厚度較薄，內部組織中見由多個軟骨細胞組成的軟骨島，其中部分軟骨細胞存在胞膜皺縮退化現象，軟骨島周圍有礦化帶，而在細胞組未見明顯軟骨島形成。8周光鏡下可見藥物+細胞組形成更為成熟的板層骨，孔隙相連，骨膠原和鈣沉積較多，屬類松質骨樣骨。新形成的骨外有骨膜包繞，光鏡下可觀察到骨膜下成骨，見圖1（封二）。

2.3 電鏡觀察 高倍掃描電鏡下觀察8周取樣標本，可見藥物+細胞組形成的板層骨為類似松質骨樣結構，有較多的孔隙，孔隙的孔壁上有較多的成骨細胞，纖維樣膠原由成骨細胞所分泌，且在膠原之間聚集著較多的顆粒狀礦物質。骨膠原與顆粒狀的礦物質相互包繞形成結節樣突出；細胞組形成更疏松、更欠成熟的類松質骨樣結構，并且只有少量纖維樣膠原和鈣結節形成，見圖2（封二）。

3 討論

MC3T3-E1細胞是一種通過分離培養從胎鼠顱骨中所獲取的前成骨細胞，具備向成骨細胞單向分化的特性，具有相應的成骨化能力，而且其細胞形態、表型和功能均與成骨細胞相似。成骨細胞雖為成熟細胞但不具備分裂增殖能力，而前成骨細胞具有強大的分裂增殖的能力，因此，MC3T3-E1細胞是研究成骨細胞的常用替代細胞系[3]，該細胞體外培養下能夠分泌ALP，I型和Ⅲ型膠原，形成鈣結節[4]，植入動物肌袋內后具有形成板層骨的能力，因此本實驗選擇MC3T3-E1細胞作為實驗細胞，觀察傷科接骨片的促成骨能力。

實驗發現，大體、光鏡和掃描電鏡觀察，藥物+細胞組和細胞組兩組雖然MC3T3-E1的成骨結構相似，但成骨能力前者要高于后者。前者實驗組中所形成的類似于松質骨樣的板層骨更為成熟，骨結構中有較多的成骨細胞以及多個孔隙相通，成骨細胞分泌較多的膠原和礦物質顆粒，兩者相互纏繞形成結節突向孔隙內。骨折愈合是一個復雜的病理過程，成骨模式有成骨細胞直接成骨、軟骨內成骨和骨膜下成骨。成骨細胞的再生是骨折愈合的基礎，在充分的血液供應下，骨折局部間葉細胞分化為成骨細胞的數量增加，因此，成骨細胞所形成骨基質和基質鈣化亦得到保證。姜琳等[5]觀察到，小鼠骨折2周，傷科接骨片組小鼠骨痂中見到成熟活躍的成骨細胞。本實驗中也觀察到類似現象，藥物+細胞組中成骨細胞數量遠遠多于對照組。由此可見，傷科接骨片可以促進動物骨痂中的成骨細胞增殖分化。

骨中的膠原纖維主要為I型膠原，占全部膠原的90%，是成骨細胞合成的特異性膠原，在骨組織中具有加大機械力量的作用。傷科接骨片中的動物類藥（海星、雞骨、土鱉蟲）可以為骨膠原合成提供所必需的多種氨基酸，發揮其促進膠原合成的作用。魏玉玲等[6]觀察到傷科接骨片藥物組與對照組比較，I型膠原mRNA的表達量無論在骨折后2周或4周，前者均大于后者，說明傷科接骨片能促進骨折的骨化和塑型，增進骨折愈合的質和量。本實驗中，也同樣發現藥物+細胞組中纖維性膠原生成量高于細胞組，顯示傷科接骨片可通過激活成骨細胞的活性促進膠原合成，從而達到促進骨折愈合的目的。此外，傷科接骨片富含的鈣質可成為軟骨成骨和骨痂的改造塑形的鈣質來源，也為本實驗中藥物+細胞組新生骨內含量較多的鈣顆粒提供了來源依據。已有研究[7]證實，接骨片能縮短類骨質的礦化延遲時間，促進類骨質提前鈣化，使骨痂提早成熟。

綜上所述，傷科接骨片可以促進MC3T3-E1細胞在動物體內的成骨作用，有利于成骨細胞的增殖分化，膠原合成及基質鈣化等，故對骨折愈合有明顯的促進作用。

［1］宮麗，張繼平.傷科接骨片促進骨折愈合研究進展［J］.中國中醫藥信息雜志，2006，13（5）：92-94.

［2］張一，孫立，簡月奎，等.雙基因活化納米骨漿的體內成骨［J］.中國組織工程研究，2014，18（3）：329-334.

［3］Calvert JW，Chua WC，Gharibjanian NA，et al.Osteoblastic phenotype expression of MC3T3-E1 cells cultured on polymer surfaces［J］.Plast Reconstr Surg，2005，116（2）：567-576.

［4］Chen VJ，Smith LA，Ma PX.Bone regeneration on computerdesigned nano-fibrous scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27 （21）：3973-3979.

［5］姜琳，魏玉玲，楊洪平，等.傷科接骨片促進實驗性骨折愈合的超微結構觀察［J］.中醫正骨，2000，12（11）：3-4.

［6］魏玉玲，王炳南，粱克玉.傷科接骨片對I、II型膠原基因表達的影響［J］.中醫正骨，1998，10（5）：3-5.

［7］黃長聯，董海輝，周建光，等.跌打接骨片促進實驗性骨折愈合的骨組織形態計量學研究［J］.中醫藥研究，2001，17 （4）：47-49.

（收稿：2015-12-14 修回：2016-01-12）

Effects of Shangke Jiegu Tablet onthe Role of MC3T3-E1 Cells in Osteogenesis PromotionIn Vivo

ZHANG Li1,GAO Jianli2,ZHANG Hua3,LI Zhaodong1. 1 Department of Clinical Laboratory,Traditional Chinese Medical and Western Medical Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310003),China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Deparptment of Orthopaedic Surgery,Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310009),China

ObjectiveTo investigate the effects of Shangke Jiegu Tablet on the the role of MC3T3-E1 cells in osteogenesis promotionin vivo.MethodsThirty healthy BALB/c mice were randomly divided into 3 groups（10 rats each）:drug+cell group,cell group,and negative control group.During the animal operation,the muscle pouch was made in the right thigh of the mouse,and the sterile gelatin sponge was used to absorb the MC3T3-E1 cell suspension or saline.Conventionaldiet was given after operation,and 3days later,the above groups were given treatment by gastrogavagerespectively as follows:Shangke Jiegutablets（0.35g/tablet）withdistilled water toa concentration of 20mg/mL suspension,and 2.0mg/（g·d）in drug+cell group;2.0mg/（g·d）of distilled water incellgroup and negative controlgroup.Every 5 mice were executed at 4 and 8 weeks after oral adiministration,and the specimens were harvested and observedwith HE staining and light microscope and scanning electron microscopy.ResultsFour weeks after operation,the new bone appeared in the drug+cell and cell groups;at 8 weeks,the cancellous bone with a lamellar structure was formed in both groups.In drug+cell group,more mature cancellous bone,collagen secreted by osteoblasts,and calcified nodules were formed compared withcell group.No new bone was observed in negative control group.ConclusionShangke Jiegu tablet is conducive to the osteogenesis induced by MC3T3-E1 cells in vivo.

Mice;Shangke Jiegu tablet;MC3T3-E1 cells;Osteogenesis

高等學校博士學科點專項科研基金（No.20110101120122）

1.浙江中醫藥大學附屬中西醫結合醫院檢驗科（杭州310003）；2.浙江中醫藥大學（杭州 310053）；3.浙江大學醫學院附屬第二醫院骨科（杭州 310009）

李召東，E-mail：dglihh@126.com