青蒿琥酯對白血病細胞增殖和凋亡的影響

孫艷美　趙良中　李　強　鐘　越　李　妍

(吉林醫藥學院檢驗學院，吉林　吉林　132013)

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青蒿琥酯對白血病細胞增殖和凋亡的影響

孫艷美趙良中李強鐘越李妍

(吉林醫藥學院檢驗學院，吉林吉林132013)

摘要〔〕目的研究青蒿琥酯對髓系白血病細胞株K562的增殖抑制和凋亡作用，分析其抗腫瘤機制。方法體外培養K562細胞，應用不同濃度的青蒿琥酯處理細胞，臺盼藍染色分析細胞活力，WST-1還原法檢測細胞增殖，流式細胞術分析細胞凋亡和周期，采用免疫印跡技術分析Bax和Bcl-2表達。結果K562細胞活力隨著藥物濃度的增加而下降，而FTY720對細胞增殖的抑制作用隨藥物濃度增加而增加。藥物作用72 h，K562細胞的IC50值為95 μmol/L；與對照組比較，50 μmol/L和100 μmol/L青蒿琥酯處理48 h導致S期細胞減少，G2M期細胞增加；當濃度達到200 μmol/L后，G2M期細胞減少，但死亡細胞增加到39.65%。雙染和流式細胞術分析發現，100 μmol/L青蒿琥酯作用24 h后，早期凋亡細胞百分率增加；與對照組比較，青蒿琥酯導致細胞內Bax表達增加。結論青蒿琥酯可通過誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖而發揮抗腫瘤作用，其線粒體途徑可能參與細胞凋亡過程。

關鍵詞〔〕青蒿琥酯；白血病；凋亡

第一作者：孫艷美(1978-)，女，講師，碩士，主要從事中草藥免疫作用研究。

青蒿素(artemisinin)是中草藥黃花蒿中的抗瘧成分，青蒿琥酯(artesunate)為其酯化學修飾的水溶性衍生物〔1〕，對體外培養的肝癌細胞、乳腺癌細胞和肺癌細胞均有不同程度的抑制作用〔2〕。青蒿琥酯抗腫瘤機制涉及誘導活性氧(ROS)產生及ROS依賴的DNA損傷、抑制血管生成、誘導凋亡和細胞周期阻滯〔3〕，但對白血病細胞增殖和凋亡研究較少。本實驗將探索青蒿琥酯對白血病K562細胞活力、增殖、周期和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640培養液(北京邁晨科技有限公司)；青蒿琥酯、臺盼藍(百靈威生物科技有限公司)；WST-1、PI(碧云天生物科技有限公司)；Annexin-V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒(購自美國eBiocience公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養實驗前1 w，自液氮中復蘇K562細胞，在含有10%血清的1640培養液中培養，每周傳代3次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2細胞活力檢測接種K562細胞于6孔細胞培養板，實驗組加入青蒿琥酯至終濃度分別為12.5,25,50,100,200和400 μmol/L，繼續培養至24 h。吹打混勻細胞，取細胞懸液50 μl，加入等量0.4%的臺盼藍染液，染色2 min后，加入血細胞計數板，計數四角大方格細胞總數和藍色細胞數。細胞活力(%)=活細胞數/細胞總數×100%。

1.2.3細胞凋亡檢測收集不同濃度青蒿琥酯處理24 h的K562細胞，每組取1×106個細胞，雙染凋亡緩沖液洗滌1次，200 μl緩沖液懸起細胞，加入5 μl的Annexin-V FITC，室溫避光孵育30 min。緩沖液洗滌2次，400 μl的緩沖液重懸細胞，加入5 μl PI染液后用流式細胞儀檢測分析。

1.2.4細胞增殖檢測接種細胞于96孔細胞培養板，分別加青蒿琥酯至0，12.5，25，50，100，200和400 μmol/L，培養至68 h；對照組和實驗組每孔加入WST-1溶液20 μl，空白組加入20 μl PBS，繼續培養至72 h。用多功能酶聯檢測分析儀檢測450 nm各孔吸光度值(A450)，取3次實驗的均值代表最終濃度。按公式計算細胞增殖抑制率(IR)。IR(%)=〔1-(實驗組A450-空白組A450)/(對照組A450-空白組A450)〕×100%。

1.2.5細胞周期分析收集不同濃度青蒿琥酯處理至48 h的K562細胞，PBS洗滌2次后用80%甲醇溶液固定細胞，置于-20℃保存。檢測前，離心棄上清，PBS洗滌細胞，用400 μl的PI染色液重懸細胞，室溫染色30 min后流式細胞術分析。

1.3統計學分析計量資料組間比較行t檢驗。

2結果

2.1不同濃度青蒿琥酯對K562細胞活力的影響隨著青蒿琥酯(0，12.5,25,50,100,200和400 μmol/L)藥物濃度的增加，細胞活力下降，依次為(98.9±2.3)%，(94.0±6.5)%(94.4±4.5)%，(88.2±5.2)%，(75.4±6.4)%，(67.0±4.8)%，(37.9±6.2)%。

2.2青蒿琥酯對K562細胞凋亡的影響100 μmol/L青蒿琥酯作用24 h后，早期凋亡(2.48±0.9)%、晚期凋亡(9.96±1.5)%和壞死細胞(3.25±0.5)%均比對照組(1.46±0.7)%、(2.79±0.6)%、(1.68±0.4)%增加。

2.3青蒿琥酯對K562細胞Bcl-2家族分子表達的影響100 μmol/L青蒿琥酯作用24 h后，細胞內Bax表達增加，Bcl-2表達無明顯變化。見圖1。

圖1　青蒿琥酯對Bax和Bcl-2表達的影響

2.4青蒿琥酯對K562細胞周期的影響與對照組比較，50 μmol/L青蒿琥酯導致K562細胞S期細胞百分率減少，而G2M期細胞百分率略增加；當濃度達到100 μmol/L和200 μmol/L后，細胞發生明顯凋亡，G2M期細胞增加；較高濃度的青蒿琥酯(200 μmol/L)處理后，細胞凋亡可達39.65%，同時發現S和G2M期細胞均減少。見表1。

青蒿琥酯(μmol/L)SubG1G0G1SG2M01.56±0.2951.82±1.6625.83±0.9020.78±1.985011.19±0.911)44.31±1.281)22.84±1.731)21.66±2.3310013.34±1.271)41.77±2.051)21.09±1.551)23.80±2.421)20037.75±1.881)30.99±2.551)10.92±1.041)21.39±3.48

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05

2.5不同濃度青蒿琥酯對K562細胞增殖的影響隨著藥物濃度增加，細胞增殖受到明顯抑制，加入12.5、25、50、100、200、400 μmol/L青蒿琥酯后，細胞增殖抑制率分別為(6.90±3.3)%，(17.8±5.5)%，(38.4±5.8)%，(52.8±6.1)%，(64.0±5.8)%，(69.9±7.2)%。50%增殖抑制濃度(IC50值)約為95.0 μmol/L。

3討論

本研究發現，青蒿琥酯處理細胞24 h，低濃度組(≤50 μmol/L)對細胞活力無明顯影響，但隨著濃度增加，細胞活力明顯下降。PI和Annexin-V雙染分析證實100 μmol/L青蒿琥酯誘導24 h，細胞以發生早期凋亡為主。

正常生長細胞若凋亡減少、分化能力異常或增殖過于旺盛，往往導致細胞轉化和癌變〔4〕。分析藥物對腫瘤細胞是否具有誘導凋亡或促進分化作用，是篩選抗腫瘤藥物的重要觀察指標。有研究報道，青蒿琥脂可導致肺腺癌細胞內ROS增加，并誘導細胞凋亡〔5〕。線粒體是細胞內氧化呼吸，產生能量的細胞器。雖然代謝過程中線粒體產生ROS，但過量的ROS將導致線粒體膜內外電位差下降，線粒體功能損傷〔6〕。Bcl-2家族成員在調控凋亡中發揮重要作用，分為抗凋亡和促凋亡兩類，前者包括Bcl-2、Bcl-XL，后者有Bid,Bax,Bad和Bim等〔7〕。抗凋亡和促凋亡分子在線粒體膜的分布，尤其是Bax與Bcl-2的比例和分布是調節線粒體膜通透性和穩定性的關鍵因素〔8，9〕。ROS與Bcl-2家族成員間具有復雜的關系，例如，ROS耦聯的轉錄因子可促進抗凋亡分子Bax和Bim的表達。本研究結果顯示，青蒿琥酯可導致細胞周期變化和誘導凋亡而發揮抗腫瘤效應,通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。本研究闡明了青蒿琥酯抗腫瘤的機制，對開發利用其新用途提供了理論依據。

參考文獻4

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3張東,王滿元,楊嵐.青蒿素類藥物新制劑研究進展〔J〕.中國藥學雜志,2015;50(3):189-93.

4Steelman LS,Franklin RA,Abrams SL,etal.Roles of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway in leukemia therapy〔J〕.Leukemia,2011;25(7):1080-94.

5周陳娟,潘文良,陳同生.青蒿琥酯誘導活性氧依賴性的細胞凋亡〔J〕.中國激光,2011;31(2)：1-5.

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〔2015-01-17修回〕

(編輯徐杰)

The effects of cell proliferation and apoptosis induced by Artesunate on leukemia cell

SUN Yan-Mei, ZHAO Liang-Zhong, LI Qiang,etal.

Academy of Laboratory，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of artesunate on inhibition of proliferation and apoptosis of myeloid leukemia cell line K562, and analyze its mechanism of antitumor.MethodsIn vitro, K562 cells were cultivated and applicated by different concentrations of artesunate. The cell vitality was analyzed by trypan blue staining. Proliferation was analyzed by WST-1 reduction method.Apoptosis and cycle of cells were analyzed by flow cytometry, Bax and Bcl-2 expressions were tested by Western blotting.ResultsK562 cell vitality decreased with the increase of drug concentration, and inhibition of cell proliferation was increased with the increase of FTY720 drug concentration. After 72 h of drug effect, K562 IC50 was 95 μmol/L.Compared with those of control group, 50 and 100 μmol/L artesunate for 48 h caused a decline of K562 cells in the S phase, and slightly increased in the G2M phase. Artesunate (200 μmol/L) induced reduction of K562 cells obviously in G2M phase,and the death rate was 39.65%. At 24 h, early apoptotic cells rate was increased in the concentration of 100 μmol/L artesunate by double staining analysis and flow cytometry. Compared with that of control group, Bax expression was higher by artesunate.ConclusionsArtesunate plays a role on anti-tumor by inducing cell apoptosis and inhibiting cell proliferation. The mitochondrial pathway may be involved in the process of cell apoptosis.

【Key words】Artesunate；Leukemia； Apoptosis

通訊作者：李妍(1972-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事基礎免疫學研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(82102953)；吉林省科技廳重大科技攻關項目(20140203012YY)；吉林省科技廳中青年科技創新領軍人才及團隊項目(20130521018JH)；吉林省衛生廳項目(2012Z076)

中圖分類號〔〕R285.6〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6647-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.003