粒細胞集落刺激因子對阿爾茨海默病大鼠腦內炎癥的影響

李　健　米永杰　石　釗　聶　政

(成都醫學院解剖組胚教研室，四川　成都　610500)

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粒細胞集落刺激因子對阿爾茨海默病大鼠腦內炎癥的影響

李健米永杰石釗聶政

(成都醫學院解剖組胚教研室，四川成都610500)

摘要〔〕目的探討粒細胞集落刺激因子(G-CSF)治療阿爾茨海默病(AD)大鼠對腦內炎癥反應的影響。方法54只Wistar雄性大鼠(3～4個月齡)，隨機選取18只作為正常組、36只制作AD大鼠模型成功后采用隨機數字表法各選取18只分別作為治療組、模型組；模型組和正常組采用HE染色法對大腦皮層組織進行觀察，治療組給予G-GCS(0.3 ml·kg-1·d-1)，模型組和正常組分別給予等量磷酸鹽緩沖液(PBS)注射，又分別于第7、14、21天進行相關指標的檢測并進行組間比較。結果正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細胞IL-1β染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14、21 d后大腦皮層細胞IL-1β染色光密度值低于模型組(P<0.05)。 正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細胞TNF-α染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14、21 d后大腦皮層細胞TNF-α染色光密度值低于模型組(P<0.05)。 結論AD大鼠對腦內炎癥反應作用顯著增強，G-CSF可以有效降低AD大鼠的炎癥反應作用，對大鼠大腦皮層細胞具有一定的保護作用。

關鍵詞〔〕粒細胞集落刺激因子；阿爾茨海默病；炎癥反應

第一作者：李健(1978-)，女，碩士，副教授，主要從事神經系統退行性病變研究。

阿爾茨海默病(AD)主要病理改變為大腦彌散性萎縮和神經細胞變性，并且以記憶障礙、失言、失認、執行功能障礙和行為改變等全面性癡呆為主要臨床特征〔1，2〕，該病發病緩慢且呈進行性發展〔3〕。目前臨床上對該病的治療包括控制伴發的精神病理癥狀和改善患者認知功能，但其治療效果差強人意〔4〕。研究表明神經炎癥在AD的發病機制中發揮重要作用，而近年來研究發現粒細胞集落刺激因子(G-CSF)具有神經保護作用〔5〕。本文探討G-CSF對AD大鼠腦內炎癥的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物54只Wistar雄性大鼠(3～4個月齡)，體重250～300 g，平均(273±10.4)g，均喂養于(23～25)℃、濕度40%～60%、光照12 h的環境中，自由進食進水。

1.2動物模型制作方法隨機選取18只作為正常組，36只制作AD大鼠模型成功后編號采用隨機數字表法各選取18只分別作為治療組、模型組；不對正常組實施任何手術措施，用 10%水合氯醛腹腔注射治療組和模型組大鼠，待大鼠麻醉后將其頭部固定在立體定向儀上，對手術區進行常規消毒，從頭背中部實施縱向切口手術，暴露出顱骨，采取顱鉆鉆開手術區顱骨。手術分兩步：第一步刀尖按前后(AP):1.8 mm、外側(L):2.5 mm、腹側(V):5.5 mm的坐標插入后，以3 mm的幅度上下抽動刀片10次。接著把刀尖上升1 mm 后，內進1 mm，以3 mm的幅度上下抽動刀片10次，確保穹窿海馬傘(FF)被完全橫斷。最后上提刀片確定無出血的情況下用骨蠟封閉創口，并在切口處撒少許青霉素粉劑進行抗炎，縫合皮膚。所有進行手術的大鼠于術后第14天開始行Morris 水迷宮定位航行訓練，連續記錄5 d大鼠的逃避潛伏期成績，取平均數，若治療組和模型組的大鼠成績明顯高于正常組，則證明建模成功。

1.3實驗儀器與藥品醫學超凈工作臺購自蘇州長留凈化科技有限公司、大鼠腦立體定位儀購自上海益聯科教設備有限公司、OLYMPUS 照相顯微鏡購自日本 SONY 公司、RM2245 石蠟切片機、HI1210 組織烘片機、HI1220 組織攤片機、EG1150H 組織包埋機購自上海徠卡儀器有限公司，Morris 水迷宮箱(中國醫學科學院)、0.9%生理鹽水、10%水合氯醛、手術器械等。

1.4實驗方法正常組及模型組腹腔注射0.3 ml·kg-1·d-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，治療組腹腔注射 0.3 ml·kg-1·d-1的G-CSF，均連續注射7 d。

1.5大腦皮層組織的HE染色于最后1次給藥結束后灌注取腦：用10%水合氯醛將大鼠麻醉后仰臥固定，暴露出心臟，將輸液針刺入大鼠的左心室，剪開右心耳后用250 ml預熱過的0.9%生理鹽水灌注，接著換成200 ml pH7.4的4%多聚甲醛灌注，待大鼠四肢抽搐僵硬時開顱取腦，并用上述灌注液固24 h。24 h過后使用常規梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。制備成厚度為4 μm的連續石蠟切片，最后行 HE染色。在光學顯微鏡下觀察各組皮層的病理形態學變化并拍照。

1.6免疫熒光檢測方法將制作完好的石蠟切片脫蠟、水化；制備新鮮的pH7.4的PBS緩沖液沖洗切片，進行抗原修復；取出切片后逐張滴加 50 μl的過氧化酶阻斷液室溫孵育20 min后用PBS 反復沖洗3 遍，每次沖洗5 min；除去多余的 PBS 液后每張切片滴加50 μl的正常非免疫動物血清室溫孵育20 min后將正常非免疫動物血清洗凈，每張切片滴加 50 μl的一抗〔白細胞介素(IL)-1β 和腫瘤壞死因子(TNF)-α的一抗〕，于4℃孵育過夜。第2天用新鮮配制的PBS 沖洗3次，每次沖洗5 min。除去多余的 PBS 液后每張切片滴加50 μl的一抗，室溫下孵育40 min。孵育結束后使用PBS 沖洗3次，每次沖洗5 min。除去多余的 PBS液每張切片滴加50 μl的鏈霉素抗生物素-過氧化物酶液，室溫下孵育40 min。PBS 沖洗后用二氨基聯苯胺(DAB)顯色具體顯色步驟如下：洗凈PBS液后再切片上滴加適量的DAB溶液，在光學顯微鏡下持續觀察，直至觀察到滿意的染色程度。

1.7免疫圖像分析分別于治療后第7、14、21天處死各組6只大鼠，每只小鼠切去6張冠狀面切片，每一張切片在預定區域內拍攝200張照片，采用隨機的方法取其方形區域內的陽性細胞進行計數，拍片腦區為大鼠大腦皮層，采用IPP5.1醫學圖像分析軟件系統分析其熒光光密度值(IOD)。

2結果

2.1正常組、模型組大腦皮層組織HE染色觀察正常組大腦皮層組織HE染色結果，可見解剖結構完整、形態正常、細胞分布均勻、神經元細胞體呈圓形或錐形，細胞的輪廓清楚，細胞排列緊密、有序、細胞核淡染，核仁明顯。模型組腦皮層組織可見大量散在的固縮凋亡細胞，細胞體積縮小、胞質濃縮、細胞核變小。見圖1。

2.23組大腦皮層組織免疫熒光染色IL-1β染色結果正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細胞IL-1β染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14 d、21 d后大腦皮層細胞IL-1β染色光密度值低于模型組(P<0.05)。見表1和圖2。

正常組

模型組

圖1正常組和模型組腦皮層組織HE染色(×400)

±s,IOD，n=18)

組別治療7d治療14d治療21d正常組38.29±8.6739.28±10.2439.12±11.46模型組93.26±17.851)146.28±21.941)86.75±14.271)治療組89.57±15.971)65.25±12.051)2)53.29±13.071)2)

與正常組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖2　各組大腦皮層組織IL-1β免疫熒光染色(標尺50 μm)

2.33組大腦皮層組織免疫熒光染色TNF-α染色結果正常組治療第7、14、21天的大腦皮層細胞TNF-α染色光密度值均顯著低于模型組、治療組(P<0.05)，治療組治療14、21 d后大腦皮層細胞TNF-α染色光密度值低于模型組(P<0.05)。見表2和圖3。

表23組大腦皮層組織免疫熒光檢測

±s,IOD,n=18)

組別治療7d治療14d治療21d正常組58.14±12.0656.17±11.3055.02±12.29模型組99.17±18.281)115.74±23.951)113.06±27.081)治療組95.02±17.141)84.02±14.271)2)62.95±15.221)2)

圖3　3組大腦皮層組織TNF-α免疫熒光染色(標尺50 μm)

3討論

流行病學研究顯示，在發達國家，AD是繼心臟病、腫瘤和腦卒中后的第四大致死性疾病，而研究數據表明在我國約有500萬人群患有AD〔6，7〕。目前臨床上對AD的治療以藥物治療為主，具體包括以下幾個方面：①改善膽堿能系統的藥物：AD患者的腦組織內尤其是額葉皮質和海馬的膽堿能系統受到損害，導致乙酰膽堿水平降低，此類藥物主要包括乙酰膽堿前體藥物(鹽酸乙酰L-肉堿)，膽堿酯酶抑制劑(他克林、多奈哌齊、加蘭他敏)，乙酰膽堿M1受體激動劑(沙利定、占諾美林等)，②谷氨酸受體拮抗劑：興奮谷氨酸能神經系統可以引起神經元興奮性中毒，因此，拮抗谷氨酸受體可以保護神經元。具體包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑和美金剛等；③抗β淀粉樣蛋白(Aβ)治療：Aβ積聚是導致AD病變的始動原因和中心環節，而Aβ是β淀粉樣前體蛋白經過三種不同的分泌酶(α、β、γ)水解而來，因此這三種酶的抑制劑可以成為治療AD的靶點。④抑制tau蛋白磷酸化藥物：利用GSK3β反義核苷酸阻斷Aβ誘導的tau蛋白磷酸化可能延緩AD的進展；⑤抗炎藥物：炎性反應參與了AD的病理改變，應用抗炎藥物能夠抑制Aβ沉積和老年斑形成，具體包括吲哚美辛、阿司匹林等非甾體類抗炎藥；⑥神經營養及生長因子：神經營養因子可以維持神經系統的功能和促進神經系統的發育，常應用神經生長因子；⑦激素類藥物：褪黑激素可以通過提高谷胱甘肽還原酶的活性而清除自由基，可以抑制tau蛋白的磷酸化，抑制神經細胞凋亡和Aβ聚集〔8〕。此外，抗氧化劑、鈣離子拮抗劑和腦代謝改善藥都被應用于AD的治療〔9〕。

G-CSF是一種由207個氨基酸組成的低分子糖蛋白，通過特異性地與G-CSF受體(G-CSFR)結合而調節粒細胞生長因子，由于其具有促進粒細胞和造血干細胞增殖分化的作用而被用于粒細胞減少癥的治療〔10〕。G-CSF在神經細胞、膠質細胞和中性粒細胞中表達較多，在抗細胞凋亡和抗炎方面具有較強的作用。研究發現，G-CSF可以通過以下幾個方面來發揮神經保護功能：①提高腦缺血壞死區細胞的存活率和減少壞死區面積；②分泌神經因子和促進血管、神經生成來促進神經功能恢復；③通過對多條抗細胞凋亡途經進行調節而增加神經元細胞和膠質細胞的存活率；此外，G-CSF 還能減少IL-6、IL-8和TNF-α的釋放而減輕炎性反應〔11,12〕。本項研究表明G-CSF能夠通過抑制IL-1β和TNF-α的表達而發揮抗炎作用，對AD大鼠大腦皮層神經元具有保護作用。這可能是由于G-CSF具有減輕小膠質細胞和Aβ沉積所致神經炎癥的功能，此外，G-CSF還可以抑制炎癥因子進入腦內造成神經炎癥，從而發揮保護腦組織的功能。

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〔2014-11-07修回〕

(編輯苑云杰)

The effect of G-CSF on brain inflammation in rats with Alzheimer's disease

LI Jian,MI Yong-Jie, SHI Zhao,etal.

Department of Anatomy and Histoembryology,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,Sichuan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)on the inflammatory reaction in the brain of rats with Alzheimer's disease(AD).Methods60 Wistar male rats(3 to 4 months of age)were randomly selected as normal group(n=21),the remaining 39 were established AD rat model to as treatment group and model group(18 each group);the three AD rats and 3 normal rats were observed on cerebral tissue using HE staining,the treatment group was given G-GCS(0.3 ml·kg-1·d-1),control and normal group were given equal volume of PBS injection,the index were detected on the 7th,14th and 21st day.ResultsThe brain cortical cells of IL-1 beta staining optical density values in normal group in 7,14,21 d were significantly lower than those of model group,those of treatment group were lower than those in model group(P<0.05).TNF alpha staining color density values of normal group in 7,14,21 d were significantly lower than those of model group(P<0.05),those of treatment group were lower than those of model group(P<0.05).ConclusionsThe effect on the cerebral inflammatory reaction in AD rat is significantly enhanced,G-CSF can effectively reduce the inflammatory reaction of AD rats presenting protection on brain cortical cells.

【Key words】Granulocyte colony stimulating factor;Alzheimer disease;Inflammatory reaction

基金項目：四川省教育廳重點項目(14ZA0231)；四川省發育再生重點實驗室專項基金(No.SYS10-006)

中圖分類號〔〕R392-3〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7027-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.027