慢病毒介導的CDK2-shRNA促進黑色素瘤細胞A375凋亡

劉厚廣　劉　卓　姜　穎　肖井仁　李紅影　李　崢　霍姍姍　于英君

(福建中醫藥大學附屬廈門市第三醫院皮膚科，福建　廈門　361100)

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慢病毒介導的CDK2-shRNA促進黑色素瘤細胞A375凋亡

劉厚廣劉卓1姜穎2肖井仁2李紅影2李崢霍姍姍于英君2

(福建中醫藥大學附屬廈門市第三醫院皮膚科，福建廈門361100)

〔摘要〕目的探討慢病毒介導的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2-shRNA對人黑色素瘤細胞A375凋亡的影響。方法依據CDK2基因序列，設計3條靶向干擾CDK2的序列，構建CDK2-shRNA慢病毒載體，質粒轉染人胚腎細胞株(HEK293)細胞進行慢病毒包裝，滴度測定包裝的重組pGMLV-CDK2-shRNA慢病毒，免疫印跡檢測對CDK2的干擾效率及對細胞周期蛋白(cyclin)E、E2F1、RB蛋白表達的影響，四甲基偶氮唑藍比色(MTT)檢測細胞增殖活力，Annexin V-FITC/PI染色流式細胞儀檢測A375凋亡的發生。結果成功獲得包裝的重組pGMLV-CDK2-shRNA慢病毒，病毒滴度為5×108TU/ml。重組的pGMLV-CDK2-shRNA慢病毒能有效下調CDK2、cyclinE、E2F1蛋白表達，抑制A375細胞增殖和觸發凋亡。結論基于慢病毒介導的CDK2-shRNA能夠促進黑色素瘤細胞A375凋亡發生，為黑色素瘤的基因治療提供理論支撐。

〔關鍵詞〕黑色素瘤；細胞周期蛋白依賴性激酶；慢病毒載體；凋亡

1吉林大學中日聯誼醫院普通外科

2黑龍江中醫藥大學生化教研室

第一作者：劉厚廣(1976-)，男，博士，主治醫師，主要從事皮膚腫瘤的分子生物學研究。

黑色素瘤的發病率在全球范圍內呈現遞增趨勢〔1〕。淺表擴散性黑色素瘤(SSM)、惡性雀斑樣痣黑色素瘤(LMM)、結節性黑色素瘤(NM)和肢端雀斑樣痣型黑色素瘤(ALM)為目前嚴重威脅人類生命健康的黑色素瘤〔2〕。細胞周期蛋白(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)共同調控著細胞周期的有序運行。已有研究表明CDK2在原發性和轉移性黑色素中高表達，同時CDK2也調控著黑色素瘤細胞由G1期向S期的轉變〔3〕。本文通過慢病毒介導的CDK2-shRNA研究對人黑色素瘤細胞株(A375細胞)增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料pGMLV-SC5慢病毒載體(吉滿生物)；黑色素瘤細胞A375、人胚腎細胞株(HEK293T)為本實驗室保存；BamHI、EcoRI、T4 DNA連接酶(Fermentas)；PCR膠回收試劑盒(寶生物)；Dpα感受態(天根生物)；DMEM培養基、胎牛血清(Gibco)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；CDK2、cyclinE、E2F1、RB、actin(CST)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(碧云天)；梓根過氧化物酶(HRP)標記對應源性IgG(北京博奧森)；聚偏氟丙烯(PVDF)膜(Pall公司)；電化學發光法(ECL)發光液(Thermo)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(天根生物)。

1.2CDK2-shRNA靶序列設計及重組CDK2-shRNA慢病毒載體構建依據公布的人CDK2基因序列，設計3條RNA干擾靶點序列(CCTGTTCGTACTTACACCCAT；GCCTGATTACAAGCCAAGTTT；CCTCAGAATCTGCTTATTAAC)，化學合成3對含有BamHI和EcoRI酶切位點互補的單鏈RNA干擾、退火形成3條雙鏈的shRNA、BamHI和EcoRI酶切pGMLV-SC5慢病毒載體和雙鏈shRNA，膠回收酶切產物，T4 DNA連接酶進行連接反應，將連接產物轉化至Dpα感受態，挑取單克隆菌落進行搖菌并提取質粒進行序列測定。

1.3重組CDK2-shRNA慢病毒包裝及滴度測定轉染前1 d將生長狀態良好的HEK293T細胞消化接種至10 cm細胞培養皿中，待細胞生長至70%～80%時進行質粒轉染，按照每個10 cm細胞培養皿轉染10 μg CDK2-shRNA重組質粒配置轉染復合物，室溫靜置15～20 min后進行細胞轉染，轉染18～20 h后去除含有轉染復合物的細胞上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后添加15 ml新鮮DMEM培養基繼續培養，48 h后收集細胞上清至50 ml離心管中，4 500 r/min、4℃離心5 min，離心后上清進行0.45 μm濾膜過濾，將濾液分批轉移至centrifugal filter裝置中4 500 r/min、4℃離心10 min，待所有濾液轉移完畢后4 500 r/min、4℃離心20 min，過濾裝置上層存留液體極為濃縮的重組CDK2-shRNA慢病毒，分裝后-80℃保存重組慢病毒。將獲得的重組CDK2-shRNA慢病毒進行10倍梯度稀釋，將梯度稀釋液接種至96孔板，每孔接種90 μl梯度稀釋的重組CDK2-shRNA慢病毒，每個稀釋梯度接種8個復孔，37℃培養，待接種第3天去除含重組CDK2-shRNA慢病毒的培養基，加入100 μl新鮮培養基，第5～6天熒光顯微鏡觀察每孔熒光細胞數量，計算重組CDK2-shRNA慢病毒病毒滴度。

1.4重組CDK2-shRNA慢病毒對黑色素瘤細胞A375增殖的影響選取包裝成功的其中一個重組慢病毒進行如下實驗，以未感染重組CDK2-shRNA慢病毒的黑色素瘤細胞A375為正常細胞對照組，以含有CDK2陰性對照的CDK2-shRNA-NC重組慢病毒感染為陰性對照組，以CDK2-shRNA重組慢病毒為實驗組感染人黑色素瘤細胞A375，分別于感染后24、48、72 h按照四甲基偶氮唑藍比色(MTT)檢測細胞增殖的方法檢測A375的增殖情況。

1.5重組CDK2-shRNA慢病毒對黑色素瘤細胞A375細胞周期相關蛋白的影響依照上述實驗分組，提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離不同分子量的蛋白，用含有20%甲醇的轉膜液100 V轉膜60 min，將蛋白轉移至PVDF膜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗PVDF膜5 min后用含有5%胎牛血清(BSA)的TBST封閉液室溫封閉1 h，用5%BSA的TBST按照1∶1 000的稀釋比例稀釋CDK2、cyclinE、E2F1、RB抗體，4℃孵育過夜。TBST清洗3次完成后HRP標記的IgG二抗室溫孵育1 h、TBST清洗3次完成后、ECL發光液進行發光、暗室內進行顯影和定影。

1.6Annexin V-FITC/PI染色檢測凋亡依照上述實驗分組，重組CDK2-shRNA慢病毒感染人黑色素瘤細胞A375 48 h后，PBS清洗細胞3次，胰酶消化后添加適量PBS終止胰酶消化，1 200 r/min離心5 min收集細胞，PBS重懸細胞并計數，取含有5～10萬個細胞的細胞懸液，1 200 r/min離心5 min收集細胞，向細胞沉淀中加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，加入10 μl碘化吖啶(PI)染色液輕輕混勻，室溫避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，染色完成后流式細胞儀檢查熒光信號強度。

1.7統計學方法采用SPSS13.0進行t檢驗。

2結果

2.1重組CDK2-shRNA慢病毒構建成功并顯著降低CDK2蛋白的表達依據CDK2基因設計的3條shRNA干擾靶序列經克隆、測序、細胞轉染和病毒包裝，熒光顯微鏡檢查3個重組慢病毒均有較強的綠色熒光，因此將包裝成功的含有CDK2-shRNA的重組慢病毒分別命名為重組pGMLV-CDK2-shRNA1、pGMLV-CDK2-shRNA2、pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒(圖1A)。病毒滴度測定結果顯示3個重組慢病毒的病毒滴度均為5×108TU/ml。免疫印跡檢測結果顯示3個重組慢病毒均可顯著降低CDK2蛋白的表達，重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒抑制CDK2蛋白表達的效果更為顯著(圖1B)。

2.2重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒抑制黑色素瘤細胞A375的增殖重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒可抑制人黑色素瘤細胞A375的增殖，且抑制效應具有明顯的時間依賴性。免疫印跡檢測結果顯示重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒可有效降低cyclinE、E2F1蛋白的翻譯水平，然而并未提高RB蛋白的翻譯水平，見圖2，表1。

圖1　CDK2-shRNA重組慢病毒鑒定及CDK2蛋白表達的免疫印跡檢測

圖2　重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒抑制A375的增殖

時間A375shRNA-NCshRNA324h1.035±0.0121.005±0.0090.887±0.02948h1.247±0.0051.055±0.0090.900±0.01372h1.416±0.0071.330±0.0080.931±0.005

2.3重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒促進人黑色素瘤細胞A375凋亡發生A375細胞對照組僅有1.2%的早期凋亡細胞；重組pGMLV-CDK2-NC慢病毒感染A375后，有4.1%的細胞發生早期凋亡，1.8%細胞為晚期凋亡細胞；重組pGMLV-CDK2-shRNA3慢病毒感染A375細胞后，凋亡早期的細胞比例提升至16.6%，凋亡晚期的細胞比例提升至7.8%，A375細胞發生明顯的凋亡。

3討論

遺傳因素和外界諸如紫外線照射等均可引起人類黑色素瘤的發生〔4〕。然而細胞周期調控的紊亂是引起腫瘤發生的根本因素。正常的細胞周期缺失任何一個節點都會導致細胞增殖紊亂、基因組不穩定和癌癥生產〔5，6〕。細胞收到有絲分裂刺激后，細胞從靜止期G0期釋放；G1期早期cyclinD開始表達并活化CDK4、CDK6，cyclinD-CDK4/6復合物啟動RB家族成員磷酸化，磷酸化完成后RB釋放E2F轉錄子起始諸如CCNE1基于轉錄，使細胞通過限制節點。G1期晚期，cyclinE-CDK2復合物磷酸化RB的另一磷酸化位點，E2F誘導DNA復制所需要的蛋白表達，而cyclinA-CDK2復合物維持RB蛋白的磷酸化狀態〔7〕。CDK2是一種Ser/Thr蛋白激酶，編碼298個氨基酸，分子量為34 kD〔8〕。CDK2單體不具有激酶活力，需與其調節配體分子cyclinE或cyclinA非共價結合形成異源二聚體復合物才可被活化〔9〕。已有研究表明CDK2與黑色素瘤的發展和進展有關，CDK2在原發性和轉移性黑色素瘤組織中呈現高表達，但正常的痣和原位黑色素瘤中表達正?！?〕。目前關于黑色素瘤的治療主要包括外科治療和化學藥物治療，靶向CDK2的抑制劑也有報道〔10〕。隨著分子生物學技術的發展，基因治療成為一種新型的治療措施。

4參考文獻

1Bishop JN,Bataille V,Gavin A,etal.The prevention,diagnosis,referral and management of melanoma of the skin:concise guidelines〔J〕.Clin Med,2007;7(3):283-90.

2Mccourt C,Dolan O,Gormley G.Malignant melanoma:a pictorial review〔J〕.Ulster Med J,2014;83(2):103-10.

3Abdullah C,Wang X,Becker D.Expression analysis and molecular targeting of cyclin-dependent kinases in advanced melanoma〔J〕.Cell Cycle,2011;10(6):977-88.

4Mouret S,Forestier A,Douki T.The specificity of UVA-induced DNA damage in human melanocytes〔J〕.Photochem Photobiol Sci,2012;11(1):155-62.

5Malumbres M,Barbacid M.To cycle or not to cycle:a critical decision in cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2001;1(3):222-31.

6Malumbres M,Barbacid M.Cell cycle,CDKs and cancer:a changing paradigm〔J〕.Nat Rev Cancer,2009;9(3):153-66.

7Lapenna S,Giordano A.Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2009;8(7):547-66.

8Tsai LH,Harlow E,Meyerson M.Isolation of the human CDK2 gene that encodes the cyclin A-and adenovirus E1A-associated p33 kinase〔J〕.Nature,1991;353(6340):174-7.

9Malumbres M,Barbacid M.Cell cycle kinases in cancer〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2007;17(1):60-5.

10Cuomo ME,Platt GM,Pearl LH,etal.Cyclin-cyclin-dependent kinase regulatory response is linked to substrate recognition〔J〕.J Biol Chem,2011;286(11):9713-25.

〔2015-03-26修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目：廈門市衛生局資助項目(No.3502Z20130190)；廈門市同安區科技局資助項目(No.20120081)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6345-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.012