HBV小鼠模型與肝臟免疫學研究進展

李鳳磊　郝曉磊　田志剛

(中國科技大學免疫學研究所, 合肥230027)

·專家述評·

HBV小鼠模型與肝臟免疫學研究進展

李鳳磊郝曉磊田志剛

(中國科技大學免疫學研究所, 合肥230027)

[摘要]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus， HBV)嚴重威脅人類健康，免疫紊亂是主要病理學機制。由于HBV不能自然感染小鼠，研究者試圖創建HBV小鼠模型，以模擬HBV的免疫病理學過程。本文將介紹各種HBV小鼠模型的構建方法，包括HBV轉基因技術、HBV病毒活體肝臟靶向轉染技術以及HBV自然感染人源化小鼠技術等，同時還分析了各HBV小鼠模型的優缺點、利用這些模型所解決的一系列免疫學問題，以及該領域的發展展望。

[關鍵詞]乙型肝炎病毒；小鼠模型；轉基因；人源化；病毒免疫

李鳳磊(1986年-)，博士后研究員。2008年和2013年于中國科學技術大學分別獲得理學學士和理學博士學位，主要從事肝臟免疫微環境和肝腸作用機制的研究。主要成果發表于Gastroenterology、J Immunol、Cell Mol Immunol等學術刊物。以第一負責人主持國家自然科學青年基金、中國博士后科學基金和中國博士后特別資助基金等。

田志剛(1956年- ),中國科學技術大學生命科學學院教授、博士生導師,現任中國科技大學生命科學學院免疫學研究所所長、中國免疫學會理事長、中國免疫學會英文會刊(Cell Mol Immunol)執行主編、中文會刊《中國免疫學雜志》主編。2001 年國家杰出青年獲得者、2007 年教育部創新團隊負責人、2008 和2011 年國家基金委《天然免疫與重大疾病發生發展》創新群體負責人、2008 年國家自然科學二等獎(首位)、2011 年國家科技進步二等獎(第二位)。主要從事天然免疫和肝臟免疫學研究,以通訊作者在Cell、Nat Immunol、Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nature Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol等SCI 收錄的國外雜志發表論文220篇。

1簡介

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)HBV是一種嗜肝性病毒，全世界約有20億人感染過HBV，其中3億會成為慢性HBV攜帶者并最終發展成肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，每年有超過60萬人死于慢性HBV感染，因此HBV感染是一個嚴重的公共衛生問題[1]。

HBV基因組是約3.2 kb的雙鏈松散環狀DNA，包含一條完整的負義鏈以及部分的正義鏈。HBV感染肝細胞后，不穩定的rcDNA (relaxed circular DNA)會形成穩定的共價閉合環狀DNA (covalently closed circular DNA， cccDNA)，cccDNA可以轉錄出不同長度的mRNA，進而翻譯成HBV各組分蛋白，包括表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBsAg)、e抗原(Hepatitis B virus e antigen， HBeAg)、核心抗原(Hepatitis B virus core antigen， HBcAg)和X抗原(Hepatitis B virus X antigen，HBxAg)，進而包裝成新的病毒顆粒釋放到細胞外[2]。在HBV感染、誘導耐受以及致病的過程中免疫系統發揮著巨大的作用，因此HBV相關的免疫學研究極為重要。

1.1肝臟免疫應答肝臟是人體最大的代謝器官，也是典型的天然免疫優勢器官[3]。肝臟有特殊的血供，其70%的血液由肝門靜脈提供，其中富含食物抗原和腸道微生物代謝產物。動脈血與靜脈血在血管壁疏松的肝竇處混合，并通過肝竇內皮細胞(LSEC, liver sinusoidal endothelial cell)與肝實質發生廣泛的物質交換。肝臟中存在著大量的天然免疫細胞，包括枯否細胞(Kupffer cell)、樹突狀細胞(Dendritic cell， DC)、自然殺傷細胞(Natural Killer cell， NK cell)、自然殺傷T細胞(Natural Killer T cell， NKT cell)[4]；另一方面，肝臟中表達高濃度的負調性細胞因子，包括白細胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)；肝臟同時也高表達抑制性受體，比如程序性死亡配體(Programmed death ligand 1, PD-L1)以及細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)等[5]。這種獨特的生理結構和免疫細胞組成使得肝臟一方面可以清除病原體，另一方面，又可對食物來源的抗原以及部分嗜肝性病毒形成耐受。

1.2HBV免疫應答的研究模型HBV宿主具有嚴格的種屬限制，除人類外，黑猩猩和樹鼩也可以被HBV病毒感染，但是黑猩猩只能形成急性的HBV感染，不能形成慢性攜帶[6]，樹鼩模型則沒有清晰的免疫學背景，無法進行免疫學研究[7]。

實驗小鼠是一種成熟的免疫學研究工具，但是其不能被HBV自然感染，因此研究者通過轉基因、肝臟靶向性轉染和構建人源化小鼠的方法，構建了多種用于免疫學研究的HBV的小鼠模型(圖1)，接下來將從模型構建和免疫學應用兩個方面對其進行總結。

2HBV小鼠模型的構建歷史

HBV轉基因(HBV transgenic，HBV-Tg)小鼠為了研究HBV各組分蛋白在感染過程中的作用， Chisari[8]和Babinet等[9]在1985年首先構建了初代的HBV轉基因小鼠，他們將HBV基因組片段加載于不同的質粒中，并通過胚胎注射將該片段與啟動子序列同源重組于小鼠的基因組上，使其能夠表達HBsAg和HBx蛋白。隨后，HBV其他組分的轉基因小鼠也相繼問世[10]，例如Burk等[11]構建的HBV small S轉基因鼠，Koike等[12]構建的HBx轉基因鼠，Milich等[13]構建的HBeAg轉基因鼠，Guidotti等[14]構建的HBcAg轉基因鼠等等。Chisari等[15]在1986年構建了一種利用Alb啟動子實現肝臟特異性表達HBV組分的轉基因鼠，其只有肝臟高表達HBV large S蛋白。該小鼠因為其肝細胞表型變化及免疫耐受狀態跟人類HBV患者相似，而被得到廣泛應用[16,17]。不過隨著周齡的增長，該小鼠會逐漸降低其HBsAg表達，隨之其肝炎水平也會逐步下降，其機制可能和DNA甲基化相關[18]。Chisari研究組[19，20]進一步成功構建了HBV全病毒轉基因鼠，重組1.3倍的HBV基因組于小鼠基因組中可以使其表達HBV的全部組分，并包裝出完整的HBV病毒顆粒，該毒顆粒在電子顯微鏡下觀察與HBV病毒顆粒無差別，且對黑猩猩具有感染性。

HBV轉基因小鼠極大地促進了HBV病毒學的研究，它揭示了HBV各組分在細胞內的表達與合成途徑[14]。HBV轉基因小鼠是第一種建立在近交系小鼠上的模型，有清晰的免疫學背景，便于免疫機制探索和實驗干預，相較于樹鼩和黑猩猩模型有巨大的優勢[21,22]。HBV轉基因鼠在胚胎期即開始表達HBV成分并形成先天免疫耐受，實驗者必須重建HBV特異性免疫應答或使獲得性免疫缺陷來間接研究HBV免疫應答[23,24]。盡管如此，強免疫佐劑依然可以誘導該小鼠產生HBV特異性免疫應答，并使其HBV抗原表達降低，這對現有的T細胞選擇學說是一個挑戰[25]。

HBV轉基因小鼠模型也有先天的不足。首先，它不能用于研究HBV病毒感染肝細胞的過程；其次，cccDNA對HBV慢性攜帶狀態的形成至關重要[26]，但HBV轉基因小鼠不具有cccDNA，不能用于研究cccDNA與免疫系統的相互作用。

2.1高壓注射介導的HBV攜帶小鼠為了解決HBV轉基因鼠對HBV中樞耐受的問題，使小鼠在成年期攜帶HBV的模型被逐漸建立。Feitelson等[27]首先將3.2 kb的HBV基因組直接肝內注射給獲得性免疫缺陷的Nude小鼠，在小鼠血清中觀察到長達7個月的HBsAg表達，然而因為免疫缺陷，Nude小鼠不能用于免疫學研究。

Chisari研究組[28,29]嘗試用高壓注射的方法將pT-MCS-HBV1.3質粒導入小鼠肝臟，該質粒只能在正常小鼠體內存在7 d，而獲得性免疫缺陷的NOD-SCID小鼠則可以維持HBV1.3表達長達60 d，這說明免疫系統會限制該質粒在成年小鼠肝臟中的表達。

陳定信研究組[30]在2006年換用了不同的質粒骨架，構建了pAAV-HBV1.2高壓注射小鼠模型， 60%的C57BL/6小鼠可以維持表達該質粒超過20周，而BALB/c小鼠則不能形成攜帶，替換載體骨架也不能形成HBV長期表達，說明機體免疫狀態和載體效應共同決定著HBV載體的表達。

小鼠體內無法自然形成HBV cccDNA，藍柯研究組[31]用高壓注射的方法將loxP-Cre系統導入到小鼠肝臟，并剪接出rcccDNA以模擬HBV病毒的持續攜帶?？墒?，經過剪切的rcccDNA中仍有殘留的loxP位點，進而導致HBV聚合酶和 Large S蛋白不能正常轉錄翻譯，因此HBV-cccDNA模型小鼠還需要進一步優化。

高壓注射方法構建的HBV小鼠模型容易操作，可以利用不同的質粒骨架誘導急性的HBV排斥和慢性HBV耐受，后者也非常適合用于抗HBV藥物的篩選[32]。然而，高壓注射模型誘導的免疫應答多是針對載體本身而不是HBV，并且該模型不能模擬HBV自然感染過程且感染效率低(約5%~10%)，從而限制了其研究的意義。

2.2載體介導的HBV攜帶小鼠為了提高HBV感染小鼠的效率，腺病毒載體(Adenovirus, Ad)和腺相關病毒載體(Adenovirus associated virus，AAV)被用來將HBV基因組帶入到肝實質細胞內表達，從而形成了載體介導的HBV攜帶小鼠[33]。

Protzer教授研究組[34]首先運用加載了1.3倍HBV基因組的腺病毒尾靜脈感染小鼠，1×109i.u高劑量感染使小鼠持續表達HBV病毒蛋白組分長達2個月，并伴隨著高滴度的HBV DNA。而1×108i.u的低劑量腺病毒更可誘導長達100 d以上的HBV持續感染(HBsAg，HBeAg滴度均持續高于100 U/ml)，且不引起體內抗表面抗原抗體(anti-HBs)的產生[35]。類似的，腺相關病毒也可將HBV基因組導入成年小鼠肝臟，并誘導慢性HBV攜帶及HBsAg和HBeAg持續性高表達[36, 37]。近來，AAV8也被成功用于1.2 kb HBV基因組的轉染，其成功誘導小鼠產生長達6個月的HBV抗原，尤為重要的是，該模型小鼠可自然產生肝纖維化并伴隨膠原沉積和TGF-β上調[38]。值得注意的是，腺病毒載體還可以激活免疫系統，非復制型腺病毒作為載體表達HBV核心蛋白及修飾后的聚合酶，成功激活了HBV耐受小鼠的HBV特異性的T細胞免疫應答[39]。因此，載體介導的HBV肝臟靶向轉染模型中的免疫應答大多也是由載體本身決定，這仍舊限制著免疫學研究的深入。

2.3肝臟人源化小鼠常規HBV小鼠模型由于種屬限制性，仍然不具有HBV感染過程、cccDNA的形成以及HBV的擴散等。最合適的HBV研究靶標仍舊是人肝實質細胞，但是人原代肝實質細胞在體外培養過程中會逐漸丟失HBV的受體鈉離子-?；悄懰峁厕D運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)而無法再被HBV感染[40]。因此，研究人員嘗試將人的肝實質細胞移植入小鼠體內，以使人其維持正常的生理活性，然后再被HBV體內感染。

Ilan等[41]首先對SCID小鼠重建小鼠免疫系統，后將HBV病毒感染過人肝組織移植到該小鼠的腎包膜下，構建成了第一個人源化肝臟的HBV小鼠模型，該模型中HBV可以持續存在約20 d，但是滴度非常低。

近年來，肝臟替代的人源化小鼠模型得到了飛快的發展，三種肝臟自發或者被誘導凋亡的小鼠模型陸續被構建。其中應用最廣泛的是uPA/SCID小鼠，該小鼠是在肝臟特異性Alb啟動子下表達uPA基因，造成小鼠肝細胞的自發死亡[42]。uPA小鼠與SCID小鼠雜交后獲得T/B細胞缺失的uPA/SCID小鼠以便于外源的人肝細胞的植入[43]。uPA轉基因小鼠的繁育比較困難，技術要求高，因此鄧宏魁研究組[44]利用Tet on系統構建了Ad.TRE-uPA/SCID小鼠，實現了可控的肝臟死亡，優化了uPA小鼠系統。延胡索二酰乙酰乙酸水解酶(Fumarylacetoace-tate hydrolase，Fah)是酪氨酸代謝途徑中的關鍵酶，Fah缺陷會導致代謝產物在肝細胞中積累，引發小鼠肝細胞的死亡[45]。Azuma等[46]將Fah缺陷鼠與Rag2-/-γc-/-鼠雜交后獲得免疫系統重度缺陷的FRG缺陷鼠，人來源的肝細胞在其中達到了80%以上的高比例重建。在肝臟人源化FRG小鼠中，HBV感染效率高達50%~80%，宿主肝細胞呈現HBcAg和Fah雙陽性[47]。TK-NOG模型是在NOD/SCID/γc-/-小鼠中轉入Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)，這種小鼠在無毒性劑量的GCV作用下會自發肝細胞的死亡，為人源化細胞的植入騰出了空間[48]。TK-NOG人源小鼠也可以構建出高比例的人源化肝臟，并使HBV在小鼠體內完成完整的生命周期，以用于科學研究與藥物測試[49]。以上模型小鼠均不具有人免疫系統，因此研究者嘗試利用肝臟和免疫系統雙人源化來解決這一問題[50-52]。雙人源化小鼠模型已經獲得了初步的成果，對NOG小鼠同時轉輸HBV感染的人肝實質細胞和人HBV特異性的CTL細胞，成功誘導出HBV特異性的肝炎模型，并用于人免疫耐受機制的研究[53]。

肝臟人源化小鼠模型相較于其他的小鼠模型有明顯的優勢，即其有完整的HBV感染和復制的過程，該模型現在已用于固有免疫系統抗HBV功能的研究以及高親和力抗體的篩選[54，55]，但是其系統構建過于復雜且不穩定。人肝實質細胞的來源是其限制因素之一，而iPS誘導成肝細胞的研究為該問題提供了解決思路[56]。雖然人源化小鼠的肝實質細胞來源于人類，但是其他參與HBV疾病進程的細胞，比如Kupffer細胞、肝竇內皮細胞、星形細胞等，依然無法被人源化取代，這也限制了其科學意義。

3基于HBV小鼠模型的免疫學研究

3.1免疫防御免疫系統對HBV的防御作用直接體現于HBV高壓注射模型中，正常小鼠在注射HBV DNA后會在 2~3周內會徹底清除HBV；但是獲得性免疫細胞和NK細胞缺陷的小鼠可以被HBV持續感染長達81 d[28]。

天然免疫系統中抗HBV免疫應答最典型的代表是Ⅰ型干擾素家族。IFN-α與其受體結合以后會活化胞內Jak/Stat途徑，進而啟動下游一系列干擾素刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)的轉錄表達，ISG可以限制胞內病毒的復制。對Upa/scid/beige小鼠進行長期的IFN-α處理，可以誘導其ISG表達持續增強，并最終導致HBsAg和HBeAg表達的顯著下調[57]。在體外培養體系和人源化小鼠的研究發現IFN-α還可以通過表觀遺傳學的機制抑制HBV復制，IFN-α會促進與cccDNA結合的組蛋白的低乙?；?，并且招募轉錄共抑制子結合cccDNA，進而抑制HBV的復制[58]。對人源化小鼠注射病毒類似物發現，小鼠和人的肝實質細胞對干擾素的反應性并不同，人肝實質細胞表達更高水平的IFN-λ，而表達低水平的IFN-α和IFN-β[59]，這也暗示HBV感染過程的物種差異性。

獲得性免疫系統在抗HBV免疫應答中也發揮著至關重要的作用。細胞毒性T細胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)一般通過裂解殺傷被病毒感染的細胞的方式清除病毒，但是有趣的是CTL細胞卻通過一種非細胞毒性依賴的方式清除HBV病毒[60-62]。HBV特異性CTL轉輸可以有效清除HBV轉基因小鼠的HBV表達，但是其并不引起肝細胞死亡，而是通過分泌IFN-γ和TNF-α來影響HBV RNA結合蛋白的穩定性，進而達到抑制HBV復制的目的[63]。腺病毒載體介導的HBV載體急性感染小鼠后7 d，血清中抗體產生而病毒組分消失，這直接說明了體液免疫應答也同樣發揮著抗HBV的作用[28]。

3.2免疫耐受HBV在免疫系統的多個層面上誘導免疫耐受[64]。對HBV感染的肝臟人源化小鼠進行IFN-α注射，8~12 h后HBV RNA下調，但是24 h后其又上調。與未感染組相比，HBV感染的肝細胞胞內ISG，MyD88和TAO-1表達均下調，進一步的研究表明IFN-α在HBV感染的肝細胞內不能夠誘導STAT-1的核內轉運，說明HBV直接抑制肝實質細胞IFN-α信號[65, 66]。最近我們研究組發現，HBV感染會上調miRNA146a的表達，而其在HBx抑制IFN-α信號的過程中發揮著重要作用[67]。因此，我們設計了一種小干擾RNA來阻斷HBx對IFN-α的抑制[68]，其在體內外均展示出強大的打破HBV免疫耐受的能力。HBV轉基因小鼠肝實質細胞MHC-I分子表達下調，這進一步降低CTL和NK細胞對其識別殺傷作用，進而造成免疫耐受[69]。最新研究表明HBV感染的肝實質細胞表達凋亡蛋白抑制劑，從而抑制其自身凋亡而增強HBV耐受[70]，而利用拮抗劑阻斷這一過程可以顯著地清除HBV[71]。

HBV還可誘導獲得性免疫耐受，近年來隨著一種高壓注射PAAV/HBV1.2質粒介導的慢性HBV攜帶小鼠模型的出現，該領域取得了迅速的發展[30]。我們研究組首先對其免疫系統進行了研究，發現該HBV攜帶小鼠表現出與成年人類一致的感染和預免疫現象，即預先接受HBsAg疫苗免疫的小鼠可以抵抗HBV的慢性感染，但是如果先被HBV慢性感染，小鼠則對外周疫苗免疫無應答并形成HBV的長期攜帶，機制研究發現這種體液免疫耐受與Kupffer細胞以及IL-10有關，Kupffer細胞或IL-10缺陷會打破該耐受[72]。有趣的是，Kupffer細胞TLR2受體可以直接接識別HBcAg，并被誘導產生IL-10[73]。之后Kupffer細胞會進一步誘導肝臟Ⅰ型調節性T細胞(Type 1 regulatory T cell，Tr1 cell)產生IL-10，后者會遷移到引流淋巴結抑制Tfh和生發中心(Germinal center，GC)B細胞反應，最終導致生發中心不能形成而阻斷體液免疫應答[74]。這種IL-10依賴的負調作用是非常廣泛的，借助于該模型發現IL-10還可以直接促進NK細胞上調表達抑制性受體NKG2A，從而使NK細胞抗病毒功能下調，促進HBV免疫耐受[75]。Kupffer細胞誘導HBV免疫耐受的機制是多樣的，最新的研究表明F4/80+CD206+CD80low/+的獨特巨噬細胞亞群可以通過分泌雙調蛋白促進肝臟Treg的抑制功能[76]。γδT細胞在HBV耐受過程中也發揮著重要作用，研究表明γδT細胞會通過分泌IL-17招募骨髓來源的抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)進入肝臟，后者會抑制CTL細胞的功能，進而增強HBV免疫耐受[77]。有趣的是HBsAg在體外也可以直接促進外周血中單核細胞轉化為MDSC，這一過程主要通過ERK/IL-6/STAT3信號途徑實現[78]。針對HBV感染導致的CTL功能耗竭以及免疫負調，我們設計了一種同時包含免疫激活序列和干擾HBx序列的載體，其展示出高效的打破免疫耐受的功能[79]。

總之，HBV借助于自身的病毒組分以及肝臟免疫負調微環境在抗病毒免疫的各個環節阻擊免疫反應，促進免疫耐受。

3.3免疫反應介導的肝臟疾病肝炎：HBV轉基因小鼠雖然表達HBV各組分，但是并沒有發生肝細胞損傷，這暗示HBV病毒本身并不會導致肝細胞死亡，其相關的病理損傷可能是由免疫系統導致[80]。的確如此，給HBV轉基因小鼠轉輸HBV特異性的CTL會導致其發生急性肝炎和肝細胞損傷[23]。CTL一方面通過細胞因子依賴的非細胞毒性的方式排斥HBV感染[60, 63]，另一方面，CTL還會招募其他非HBV特異性的炎性細胞誘導肝損傷[81]。

為了研究天然免疫細胞在HBV相關的肝損傷中的作用，多種免疫刺激劑被應用到HBV轉基因小鼠體內以激活相應免疫細胞。我們研究組[82]發現，TLR3(Toll like receptor 3)激動劑Poly I:C能夠促使HBV轉基因小鼠產生更強的肝損傷，表現為增高的血清谷丙轉氨酶(Alanine transaminase， ALT)水平以及更加嚴重的肝臟炎癥病理。HBV轉基因小鼠對Poly I:C的易感性依賴于肝臟NK細胞分泌的IFN-γ，同時也發現HBV轉基因小鼠肝實質細胞在poly I:C刺激后會上調表達更多的IFN-γ受體。低劑量ConA注射也會誘導HBV轉基因小鼠產生爆發性肝炎，ConA刺激會導致NKG2D配體Rae-1和Mult-1在HBV小鼠肝實質細胞中大量表達，兩者進而通過NKG2D活化NK細胞，導致NK細胞介導的肝炎發生[16]，相應的，HBV轉基因小鼠具有特有的免疫負反饋機制，其肝臟Treg細胞通過表達模型的TGF-β和OX40來抑制NK細胞的過度活化[83]。肝再生是一個免疫系統參與的過程，HBV轉基因小鼠小鼠表現出明顯低下的肝再生能力。肝切除手術之后，HBV轉基因小鼠肝臟會大量聚集活化的NKT細胞抑制肝再生，當阻斷CD1d-NKT的交互作用后，其肝再生能力得到恢復[84]。

免疫系統攻擊導致肝炎在人源化小鼠中也得到了驗證。對uPA/SCID人源化小鼠構建人肝實質細胞后，對其轉輸半相合的PBMC細胞，隨之則發現了明顯的人免疫細胞的侵潤和NK細胞介導的肝細胞再生受損，而當對其注射anti-Fas抗體或者清除DC細胞后可以顯著抑制人肝實質細胞的死亡[85]。肝臟人源化小鼠感染HBV后會大量表達NK細胞依賴的Ifng基因，并導致肝實質細胞甲基化基因大量增多，而這些甲基化基因和肝細胞壞死及肝癌相關[86]。

3.4肝纖維化HBV轉基因小鼠自發產生肝纖維化，CCL4會加速此進程的發生，機制研究表明HBV轉基因小鼠NKT細胞過度活化并釋放細胞因子IL-4和IL-13，后者會活化肝臟星形細胞(Hepatic stellate cell，HSC)，并最終導致膠原沉積和肝纖維化[87]。最新研究則表明TGF-β-CD147正反饋途徑在此過程中也發揮著重要的作用，TGF-β通過Smad2、Smad3和Smad4上調CD147表達，而CD147則可以通過ERK1/2和Sp1上調HSC表達α-SMA、膠原酶-I以及TGF-β[88]。IL-22也參與該過程，在HBV轉基因小鼠中，阻斷IL-22信號可以顯著降低CXCL10和CCL20的表達，進而降低Th17細胞的招募，降低肝臟炎癥和纖維化的發生[89]。

HBV誘導肝纖維化的進程和機制在人源化小鼠中也得到了進一步的驗證和解析。對免疫缺陷的A2/NSG小鼠同時重建人造血干細胞和肝細胞，即A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠，HBV感染該小鼠成功模擬出了人類的免疫反應、慢性肝炎以及肝纖維化[90]。該人源化小鼠肝纖維化中觀察到了大量的人類M2型巨噬細胞，而基因分析發現后者與人類HBV患者肝纖維化和肝壞死相關[90]。

3.5肝癌免疫反應會誘導HBV相關的肝癌。最典型的證據是Chisari研究組1998年基于HBV轉基因小鼠進行的免疫系統重建的模型。對HBV轉基因小鼠(lineage 107-5)進行胸腺摘除和輻照處理以破壞其對HBV耐受的免疫系統，然后再對該小鼠進行正常小鼠來源的骨髓重建，同時轉輸HBsAg疫苗免疫過的正常小鼠的脾臟細胞，該細胞進入HBV轉基因鼠體內后會持續攻擊HBV表達的肝實質細胞，形成持續的肝炎和肝纖維化，并最終在17個月后全部發展成肝癌[91]。在HBV特異性CTL細胞招募到肝臟的過程中，血小板發揮著重要的作用，利用阿司匹林和氯吡格雷抑制血小板，可以顯著地降低肝臟中HBV特異性CTL細胞的數量，進而降低肝炎、肝纖維化和肝癌的發生[92]。事實上，非特異性的免疫攻擊也可以導致HBV相關的癌癥，CD137是CTL細胞表面重要的共刺激受體，CD137激活抗體可以顯著活化HBV轉基因小鼠中非特異性的CTL細胞分泌IFN-γ，進而激活Kupffer細胞產生TNF-α,IL-6和MCP-1促進肝硬化和肝癌的發生[93]。雖然炎癌變過程中肝細胞內的信號途徑還不是很清楚，但是有證據表明炎性信號可能誘導了肝細胞上調表達轉錄因子c-JUN/AP-1進而促進肝細胞成瘤[94]。

4展望

HBV特異性細胞受體NTCP的發現為HBV小鼠模型的建立提供了新的契機。李文輝課題組[95]發現HBV preS1肽段可以特異性地與NTCP結合，后者在人類原代肝實質細胞中大量表達。借助于這一理論突破，轉染了NTCP的人肝癌細胞系能夠成功地被HBV感染，NTCP轉染的小鼠肝實質細胞仍然不能夠被HBV感染[96,97]。研究表明這種限制可能發生在病毒進入細胞以后和病毒轉錄之前的階段，而這可能和一些特定的僅存在于人類肝實質細胞而不存在于鼠類肝實質細胞中的因子有關[98]。表達人NTPC的小鼠細胞系不能被HBV感染，但是和人肝癌細胞系HepG2融合后的小鼠細胞系均可被HBV感染，另一方面對小鼠細胞系導入cccDNA模擬分子也可以使后者成功表達HBV相關基因，這些實驗充分說明小鼠細胞系缺少人類肝細胞獨有的位于cccDNA上游的某個分子[99]。雖然該領域的研究目前進入了瓶頸狀態，但是毫無疑問，該領域的突破會解釋更多的HBV感染和致病機制，也會為新的模型的構建提供理論基礎。

雖然人源化小鼠可以成功構建人的肝實質細胞，但是其他的非實質細胞，包括LSEC、Kupffer細胞和HSC細胞很難被人源化取代。而HBV相關的病理性過程，包括肝炎、肝纖維化以及肝癌都需要肝實質細胞和其他肝臟駐留細胞的交互作用實現，因此目前的人源化小鼠還很難重建人類HBV相關的疾病。目前的人源化小鼠多是基于免疫缺陷小鼠構建，他們也不適合獲得性免疫特別是疫苗免疫學的研究。因此，肝臟免疫系統雙人源化小鼠需要進一步優化，肝細胞的取代率、病毒的感染效率以及其他組織細胞的取代都需要提高；此外，回歸基于小鼠本身免疫系統和組織細胞的研究，優化成年小鼠HBV后天感染方案。

HBV小鼠模型最初多是由病毒學家構建用以解決病毒學問題，所以，對現有的HBV小鼠模型的新的深入的免疫學解讀也非常重要。比如，在臨床上已經觀察到HBx和HBV相關的腫瘤發生有著密切的關聯[100]。之后這種現象在HBx轉基因鼠中也得到了驗證，HBx小鼠會被DDC飲食處理誘導產生肝癌[101]。有趣的是，在該腫瘤模型誘導過程中同時發現了一系列的免疫學變化，包括血清IL-6的上調和STAT3活化等，但是這些免疫反應在HBV相關腫瘤誘導過程中的具體作用還不清楚。因此，對已有HBV小鼠模型的免疫學的再分析會推動該領域的發展。

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[收稿2016-01-08]

(編輯許四平)

Research advances of HBV mouse model and liver immunology

LIFeng-Lei,HAOXiao-Lei,TIANZhi-Gang.InstituteofImmunology,USTC,Hefei230027,China

[Abstract]Hepatitis B virus (HBV) threatens human's health seriously, immune disorder is the main pathogenesis.HBV cannot naturally infect mouse liver, thus the researchers tried to established HBV mouse models to imitate the immunological pathogenesis of HBV infection.This review summarize various methods to establish HBV mouse models, including HBV transgenic technics, HBV in vivo liver-target transfection technics and HBV naturally infected humanized mouse technics etc.Their advantages, disadvantages and contributions to immunological studies were also analyzed, and the development of this area was also prospected.

[Key words]Hepatitis B virus;Mouse model;Transgenic;Humanized mouse;Viral immunology

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0145-09

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.001