阿魏酸對離體大鼠冠狀動脈的舒張作用及機制探討

房龍梅，侯曉敏，楊　蓉，范芳文，賀澤芳，石　萌，張明升

(山西醫科大學藥理學教研室，山西 太原　030001)

?

阿魏酸對離體大鼠冠狀動脈的舒張作用及機制探討

房龍梅，侯曉敏，楊蓉，范芳文，賀澤芳，石萌，張明升

(山西醫科大學藥理學教研室，山西 太原030001)

摘要：目的探討阿魏酸(ferulic acid, FA)對離體大鼠冠狀動脈的舒張作用及機制。方法采用微血管張力法，測定FA對靜息及預收縮大鼠離體冠狀動脈舒張作用；觀察內皮對FA舒張作用的影響；探討FA舒張作用與細胞外鈣內流和內鈣釋放的關系；應用鈣激活K+通道(KCa)阻斷劑四乙胺(TEA)、ATP敏感K+通道(KATP)阻斷劑格列苯脲(Gli)、內向整流K+通道(KIR)阻斷劑氯化鋇(BaCl2)、電壓依賴性K+通道(KV)阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP)、NOS抑制劑L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、環氧酶抑制劑吲哚美辛(Indo)等工具藥，探究FA舒張大鼠離體冠狀動脈的作用機制。 結果FA對大鼠離體冠狀動脈靜息張力無明顯影響；濃度依賴性的舒張KCl(60 mmol· L-1)、U46619(1 μmol· L-1)、PE(10 μmol· L-1)預收縮的大鼠冠狀動脈(P<0.05)；內皮對FA舒張作用無明顯影響(P>0.05)；FA能夠明顯抑制外鈣依賴性和內鈣釋放引起的血管收縮(P<0.05)；4-AP(1 mmol· L-1)能抑制FA的舒張作用，TEA、Gli、BaCl2、L-NAME、Indo無明顯影響(P>0.05)。結論FA對離體大鼠冠狀動脈的舒張作用可能與血管平滑肌細胞上KV通道激活、細胞肌漿網內鈣釋放、外Ca2+通道的阻滯有關，與KCa、KATP、KIR通道無關，也不依賴于內皮功能。

關鍵詞：FA；離體冠狀動脈；舒張作用；作用機制；血管環；鉀通道；鈣通道

阿魏酸(ferulic acid, FA)是一種酚類化合物，廣泛應用于食物、飲料和醫藥行業[1]。文獻報道，FA可以作為新型非肽類內皮素受體拮抗劑，拮抗內皮素收縮血管引起的冠心病，心絞痛等，也可降低氧自由基脂質過氧化損傷[1-2]和癌癥[2-3]的發生率，且具有一定的鎮靜催眠[4]、解痙鎮痛、活血化瘀、抗菌消炎[5]的作用。這些研究顯示，FA有望成為治療心血管系統疾病的一劑良藥。然而，在治療心血管疾病的同時，FA是否會通過其他途徑對血管肌源性反應產生影響及其作用機制，目前尚不清楚。據此，本實驗采用離體微血管張力測定法進一步探究其對冠狀動脈平滑肌的作用特點，為臨床應用FA治療心血管疾病提供藥理學基礎。

1材料

1.1藥品與試劑FA、血栓素A2類似物(U46619)、苯腎上腺素(PE)、四乙胺(TEA)、格列苯脲(Gli)、氯化鋇(BaCl2)、4-氨基吡啶(4-AP)、L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛(Indo)、HEPES均購自美國Sigma公司，其余為市售分析純。正常PSS液的成分為(mmol· L-1)：NaCl 118，KCl 5，CaCl22.5,KH2PO41.2,MgCl21.4,NaHCO35,HEPES 5，Glucose 10。

1.2實驗動物正常♂SD大鼠，6周齡，體質量200～250 g，購自山西醫科大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(晉)2009-0001，受試動物在本教研室觀察室喂養2周后用于實驗。

1.3實驗儀器PowerLab生物信號采集分析系統及張力換能器購自澳大利亞埃德儀器國際貿易有限公司，Multi Myograph System-610M微血管張力記錄儀購自丹麥DMT公司，Nikon解剖顯微鏡購自日本Olympus公司，PHS-3C精密pH計、sartorius BS124S精密天平等。

2方法

2.1冠脈血管環標本的制備大鼠斷頭處死后即刻取出心臟，置于4℃、pH 7.38、氧飽和的PSS液中。在解剖顯微鏡下分離出大鼠冠狀動脈的室間隔支、室壁支和前降支，剪成長約2 mm的血管環，通過兩根直徑為40μm的鋼絲固定于DMT記錄儀。具體制備方法、血管環標化及張力記錄、活性檢測參照文獻[6]。

2.2FA對離體大鼠冠狀動脈靜息及預收縮血管環張力的影響待血管環在盛有5 mL PSS液、37℃恒溫、持續通入95% O2+5% CO2氣體的浴槽中穩定1 h，期間通過順時針旋轉DMT的螺旋測微尺(每2 min 一次，每次3～5格)逐步牽拉血管，調節血管跨壁壓至80 mmHg，使其達到基礎壓力狀態，即實驗開始前的穩定狀態。再將浴槽內PSS液更換為同體積KCl(60 mmol· L-1)刺激血管環發生收縮。當連續刺激3次血管環收縮幅度差別小于10%，收縮張力達2mN[7]，認為該血管環的結構和功能符合實驗標準，開始正式實驗。在靜息狀態下，向浴槽內分別加入終濃度為 1、1.5、2、2.5、3 mmol· L-1的FA,觀察其對靜息狀態大鼠冠狀動脈張力的影響；向浴槽內分別加入KCl(60 mmol· L-1)、U46619(1 μmol· L-1)、PE(10 μmol· L-1)，當血管達到收縮坪臺時，再向浴槽內累積加入上述濃度的FA,建立FA的濃度-舒張效應曲線，觀察FA對預收縮冠脈血管環張力的影響。對照組分別加入相同體積的DMSO，排除溶劑對實驗結果的影響。以冠脈血管環達坪臺期的最大收縮幅度為100%，計算不同濃度FA的舒張百分數。

2.3內皮對FA舒張PE預收縮冠狀動脈作用的影響及L-NAME和Indo對其舒張作用的干預參照文獻[8]所述，用直徑小于冠狀動脈的毛細管輕輕插入冠脈一端，溫和的打入氣泡，重復3～5次后，可機械去除冠脈血管環內皮。利用文獻[9]方法檢測內皮的完整性。在內皮完整組和去完整組分別加入PE(10 μmol· L-1),待血管收縮達到坪臺后依次加入上述濃度的FA，觀察內皮對FA舒張PE(10 μmol· L-1)預收縮冠狀動脈作用的影響。以冠狀動脈收縮達坪臺期的幅度為100%，計算不同濃度FA的舒張百分率；在內皮完整組PE(10 μmol· L-1)預收縮達坪臺后，分別加入L-NAME(0.1 mmol· L-1)和Indo(10 μmol· L-1)預孵15min，待冠脈收縮達到第2次坪臺后再依次加入上述濃度的FA，觀察L-NAME(0.1 mmol· L-1)和Indo(10 μmol· L-1)對FA舒張作用的影響。以加入L-NAME(0.1 mol· L-1)和Indo(10 μmol· L-1)后冠脈血管環收縮達坪臺期的幅度為100%，計算不同濃度FA的舒張百分率。

2.4預孵FA對外鈣內流和內鈣釋放引起冠狀動脈收縮的影響用KCl(60 mmol· L-1)刺激冠脈血管，當血管環收縮穩定后，用含EGTA的無鈣PSS液洗脫血管環，15 min后血管環張力回到基線，使細胞外液達到一種無鈣的理想狀態；再將浴槽內的液體換成不含EGTA的無鈣PSS液，排除EGTA對復鈣后血管收縮反應的影響。15 min后將浴液更換為無鈣的KCl(60 mmol· L-1)或U46619(1 μmol· L-1)，預孵10 min加入CaCl2(2.5 mmol· L-1),血管收縮達坪臺后重復上述操作，待血管環張力第2次回到基線，先加入FA預孵15min，再加入無鈣的KCl(60 mmol· L-1)或U46619(1 μmol· L-1)，10min后復鈣，記錄預孵FA前后無鈣液中KCl(60 mmol· L-1)或U46619(1 μmol· L-1)的收縮幅度以及復鈣后的幅度變化，比較FA對外鈣內流和內鈣釋放引起冠狀動脈收縮作用的影響。

2.54種鉀通道阻斷劑對FA舒張KCl或U46619預收縮冠狀動脈作用的影響冠脈血管環穩定后向浴槽中加入KCl(60 mmol· L-1)或U46619(1 μmol· L-1)，待血管收縮達坪臺后，分別加入4種鉀通道阻斷劑TEA、Gli、BaCl2、4-AP，使其在浴槽內的終濃度分別為1、0.01、1、1 mmol· L-1，血管收縮再次達坪臺后加入FA,觀察4種鉀通道阻斷劑對FA舒張KCl或U46619預收縮冠狀動脈作用的影響。以加入鉀通道阻斷劑后冠脈血管環收縮達坪臺期的幅度為100%，計算不同濃度FA的舒張百分率。

3結果

3.1FA對離體大鼠冠狀動脈靜息及預收縮血管環張力的影響FA(1、1.5、2、2.5、3 mmol· L-1)對離體大鼠冠狀動脈靜息張力無明顯影響(P>0.05)；KCl(60 mmol· L-1)、U46619(1 μmol· L-1)、PE(10 μmol· L-1)可收縮大鼠離體冠狀動脈，最大收縮幅度分別為(2.69±0.16)mN、(4.48±0.42)mN、(6.74±0.35)mN；FA可以濃度依賴性地舒張KCl(60 mmol· L-1)、U46619(1 μmol· L-1)、PE(10 μmol· L-1)引起的離體大鼠冠脈收縮，最大舒張百分率分別為(98.39±2.92)%、(95.03±2.86)%、(91.58±2.10)%,與溶劑對照組相比差異有顯著性(P<0.01)，與KCl組相比，PE組存在顯著性差異(P<0.05)，U46619組差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 1。

3.2內皮對FA舒張PE預收縮冠脈血管作用的影響及L-NAME和Indo對其舒張作用的干預內皮完整組與去完整組FA舒張PE(10 μmol · L-1)預收縮冠狀動脈作用差異無顯著性(P>0.05),見Fig 2。預孵L-NAME(0.1 mol· L-1)和Indo(0.01 mol· L-1),血管環最大收縮強度分別達到(9.42±1.25)mN、(11.95±2.05)mN；但對FA舒張作用的影響無明顯差異(P>0.05),見Fig 3。

3.3預孵FA對外鈣內流和內鈣釋放引起冠脈收縮的影響在無鈣PSS液中，KCl(60 mmol· L-1)幾乎不引起冠脈收縮，復鈣(2.5 mmol· L-1CaCl2)后冠脈發生收縮，且收縮幅度與正常PSS液中KCl(60 mmol· L-1)引起的收縮幅度相當。預孵FA(1、1.5、2 mmol· L-1)能夠明顯抑制KCl(60 mmol· L-1)在無鈣PSS液中復鈣后誘導的外鈣依賴性血管收縮(見Fig 4)，收縮率分別為(58.35±1.61)%、(32.90±1.63)%、(2.95±0.59)%；無鈣PSS液中，U46619(1 μmol· L-1)引起冠脈收縮，最大收縮幅度為(0.84±0.07)mN,復鈣后進一步收縮。預孵FA(1、1.5、2 mmol· L-1) ，能夠抑制U46619(1 μmol· L-1)在無鈣PSS液中引起的輕微血管收縮以及復鈣后的收縮，收縮率分別為(69.35±1.52)%、(40.10±1.02)%、(6.74±0.36)%；(40.89±0.91)%、(13.74±0.43)%、(5.43±0.17)%，見Fig 5。

Relaxtions were expressed as percentages of the maximal contraction induced by KCl(60 mmol· L-1),U46619(1 μmol· L-1),PE(10 μmol· L-1)，respectively.*P<0.05,**P<0.01vsKCl.

Relaxtions were expressed as percentages of the maximal contraction induced by PE(10 μmol· L-1).*P<0.05，**P<0.01vs“End++FA”.

Relaxtions were expressed as percentages of the maximal contraction induced by PE(10 μmol· L-1)+L-NAME/Indo.

*P<0.05vscontrol.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3.4四種鉀通道阻斷劑對FA舒張U46619預收縮冠脈血管環作用的影響預孵BaCl2(1 mmol· L-1)、Gli(0.01 mmol· L-1)、TEA(1 mmol· L-1)均沒有明顯地影響FA對冠脈的舒張作用(P>0.05)，但預孵4-AP(1 mmol· L-1)使FA對U46619(1 μmol· L-1)預收縮大鼠冠脈的舒張幅度減小26.46%(P<0.05,見Fig 6)。

Relaxtions were expressed as percentages of the maximal contraction induced by U46619(1 μmol· L-1).*P<0.05vscontrol.

4討論

本實驗結果顯示：FA對靜息狀態的離體大鼠冠狀動脈的肌張力無明顯影響，可以舒張預收縮的大鼠冠狀動脈，其舒張作用可能與激活血管平滑肌上KV通道、阻斷電壓依賴性的Ca2+通道(VOCC)、抑制鈣操縱型Ca2+通道(SOC)有關，與內皮、NO及PGI2無關。

FA作為中藥川穹等的生物堿提取物[10]，有文獻報道，FA能夠降血壓，緩解心絞痛,預防經皮冠狀動脈治療(PCI)術后再狹窄，改善心功能[11]等。我們的實驗表明FA可以濃度依賴性的舒張預收縮的大鼠冠狀動脈，提示其具有舒張血管的作用。

血管平滑肌分布著K+通道和Ca2+通道，是調節血管舒縮狀態的重要機制。K+通道被抑制時，K+外流減少，細胞膜電位下降，引起VOCC的開放，鈣內流導致細胞質內Ca2+濃度增加，引起血管平滑肌收縮，相反則舒張；Ca2+是平滑肌細胞興奮-收縮偶聯的關鍵因子，外鈣內流和內鈣釋放是引起收縮的原因。細胞外鈣內流主要依賴VOCC和受體操縱型Ca2+通道(ROCC),一般地，KCl引起的冠脈收縮主要是通過激活細胞膜上的VOCC通道，而內鈣外流則主要是細胞肌漿網內鈣離子的釋放，即SOC的開放。為了探索FA舒張冠脈是否與K+通道和Ca2+通道有關，我們觀察了4種特異性K+通道抑制劑4-AP、Gli、TEA、BaCl2以及Ca2+對FA舒張冠脈作用的影響。結果表明，4-AP (1 mol· L-1)可以抑制FA的舒血管作用，Gli( 0.01 mol· L-1)、TEA (1 mol· L-1)、BaCl2(1 mol· L-1)對FA舒血管作用差異無顯著性。FA能夠抑制U46619(1 μmol· L-1)在無鈣PSS液中引起的收縮，以及無鈣PSS液中KCl和U46619復鈣后的收縮作用。這些結果提示，FA對冠脈血管的舒張作用可能與激活KV通道、抑制VOCC和SOC通道有關。

在冠狀動脈血管中，NO和PGI2是內皮依賴性的舒血管物質[12-13]。NO是由L-精氨酸和分子氧化生成的一種自由基氣體，能夠穿透細胞膜到達靶細胞，激活NO合酶(NOS)，從而引起細胞內cGMP含量升高。cGMP通過抑制Ca2+通道使細胞內Ca2+減少，舒張血管。NOS抑制劑L-NAME不能抑制FA對預收縮冠狀動脈的舒張作用，證明其舒張作用與內皮-NO-cGMP途徑無關；環氧合酶是PGI2合成的主要限速酶之一，其抑制劑Indo對FA舒張預收縮冠脈作用無影響，說明其舒張作用與PGI2途徑無關。

綜上所述，FA可以濃度依賴性的舒張預收縮SD大鼠離體冠狀動脈，其舒張機制可能與KV通道激活、VOCC和SOC通道抑制有關，與內皮、NO系統和PGI2途徑無關。

(致謝：本實驗在山西醫科大學基礎醫學院藥理教研室完成。感謝我的導師張明升教授的耐心指導，感謝本教研室的侯曉敏老師、楊蓉老師、牛龍剛老師和田晴晴同學在實驗過程中無私的幫助。也要感謝我的師妹范芳文、賀澤芳、石萌與我一起完成實驗。)

參考文獻

[1]Kaur B, Chakraborty D, Kaur G, Kaur G. Biotransformation of rice bran to ferulic acid by pediococcal isolates[J].ApplBiochemBiotechnol,2013,170(4):854-67.

[2]Fukuda T, Kuroda T, Kono M, et al. Augmentation of ferulic acid-induced vasorelaxation with aging and its structure importance in thoracic aorta of spontaneously hypertensive rats[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol,2015,388(10):1113-7.

[3]吳枝娟,余婧,王瑞幸. 阿魏酸預處理對阿霉素誘導H9c2心肌細胞損傷的保護作用[J].中國藥理學通報, 2014, 30(8): 1059-65.

[3]Wu Z J,Yu J,Wang R X. Ferulic acid pretreatment on adriamycin induced H9c2 myocardial cell injury protection[J].ChinPharmacolBull,2014,30(8):1059-65.

[4]Tu Y，Cheng S X，Sun H T，et al．Ferulic acid potentiates pento-barbital-induced sleep via the serotonergic system[J].NeurosciLett,2012,525(2):95-9.

[5]Arvind T, Sushma C, Jeffrey W, Sunil P. Ferulic acid combined with aspirin demonstrates chemopreventive potential towards pancreatic cancer when delivered using chitosan-coated solid-lipid nanoparticles[J].CellBioscience,2015,12(5):46.

[6]Hou X M, Zhang M S. Enhancement of voltage-gated K+channels and depression of voltage-gated Ca2+channels are involved in quercetin-induced vasorelaxation in rat coronary artery[J].PlantaMed,2014,80(6):465-72.

[7]Liu Y, Niu L, Zhang W, et al. Effects of taurine on contractions of porcine coronary artery[J].PharmacolRep,2009,61(4): 681-9.

[8]Menendez C, Dueas M, Galindo P, et al. Vascular deconjugation of quercetin glucuronide: the flavonoid paradox revealed?[J]MolNutrFoodRes,2011,55(12):1780-90.

[9]Bubolz A H, Li H, Wu Q, et al. Enhanced oxidative stress impairs cAMP-mediated dilation by reducing Kv channel function in small coronary arteries of diabetic rats[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2005,289(5):1873-80.

[10] 吳建良,沈敏敏,楊水新.阿魏酸對小膠質細胞炎性反應的抑制作用[J].中國藥理學通報, 2015, 31(1): 97-102.

[10] Wu J L,Shen M M,Yang S X. Inflammatory reaction inhibition of Ferulic Acid on microglial cell[J].ChinPharmacolBull,2014,31(1):97-102.

[11] Barone E, Calabrese V, Mancuso C. Ferulic acid and its therapeutic potential as a hormetin for age-related diseases[J].Biogerontology,2009, 10(2):97-108.

[12] Babettte B. Weksler prostanoids and NSAIDs in cardiovascular biology and disease[J].VasculBiol,2015,17:41.

[13] Nakmareong S, Kukongviriyapan U, Pakdeechote P, et al. Antioxidant and vascular protective effects of curcumin and tetrahydrocurcumin in rats with L-NAME-induced hypertension[J].NaunynSchmiedebergsArchPharmacol,2011, 383(5):519-29.

Vasodilatory effect of Ferulic acid onin-vitrorat coronary artery

FANG Long-mei, HOU Xiao-min, YANG Rong, FAN Fang-wen, HE Ze-fang, SHI Meng，ZHANG Ming-sheng

(DeptofCollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Key words:FA;invitrocoronary artery; vasodilator effect; mechanism；vascular ring；K+channel；Ca2+channel

Abstract:AimTo investigate the vasodilatory effect of Ferulic acid oninvitrorat coronary artery and its possible mechanism. MethodsBy using the microvessel tension recorder system, the vasodilatory effect of FA on resting and contractin-vitro rat coronary artery was determined; the influence of endothelial integrity to FA-induced vasorelaxation was observed; the relationship of FA on [Ca2+] ex-influx-induced and [Ca2+] in-efflux-induced contractions was discussed; the mechanism of vasodilatory effect of FA was explored by applying the inhibitors of KCa(TEA),KATPchannel (Gli), KIRchannel (BaCl2), KV(4-AP),NOS( L-NAME) and COX(Indo). ResultsFA had no effect on the resting tension ofinvitrorat coronary artery. FA dilated the in-vitro rat coronary artery pre-treated with KCl(60 mmol· L-1), U46619(1 μmol· L-1) and PE(10μmol· L-1) in a concentration-dependent fashion(P<0.05). FA inhibited the [Ca2+] ex-influx-induced and [Ca2+] in-efflux-induced contractions significantly(P<0.05). 4-AP(1 mmol· L-1) restrained the diastolic function of FA, while TEA,Gli,BaCl2、L-NAME,Indo had no obvious effect (P>0.05). ConclusionThe diastolic function could be related to the activation of KVchannel on vascular smooth muscle cells, the free Ca2+from Sarcoplasmic reticulum cells and blockade extracellular Calcium channel do not depend on KCa, KATP, KIRchannel, nor the endothelial function.

收稿日期：2015-11-20，修回日期：2016-01-24

作者簡介：房龍梅(1988-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學，E-mail:603980935@qq.com； 張明升(1958-)，男，博士，教授，博士生導師，通訊作者，研究方向：心血管藥理學，Tel:0351-4135172，E-mail:4156589@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.022

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0554-05

中國圖書分類號：R-332；R322.121；R329.24；R331.32；R972.4

網絡出版時間：2016-3-18 11:22網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.044.html