在骨組織愈合中炎癥反應聯合血管生成的研究進展①

袁 翰 蔣逸秋 郭 楊 馬 勇 黃桂成

(南京中醫藥大學骨傷研究所,南京210023)

在骨組織愈合中炎癥反應聯合血管生成的研究進展①

袁 翰 蔣逸秋 郭 楊 馬 勇 黃桂成

(南京中醫藥大學骨傷研究所,南京210023)

延遲愈合與骨不連仍然是骨科臨床工作中較為棘手的問題。延遲愈合發生后，甚至需要重新顯露手術，進而延長了患者在院時間，推遲了復健周期，增加治療經費負擔[1]。骨組織在愈合過程中不產生疤痕組織，這可能與骨組織獨特的愈合過程有關[2]。對骨組織愈合過程中炎癥反應、血管生成與組織重建之間關系的交叉研究將有助于揭示骨組織修復過程的調控機理。

骨損傷的愈合過程存在一系列精確調控的交替過程。骨組織的愈合過程從炎癥反應開始，免疫細胞初期釋放出炎癥因子，從而招募、富集間充質干細胞并引導其分化[3]。這一關鍵過程也與血管再生和細胞外基質的分泌和塑形相關[4]。尤其在骨折愈合過程中，肉芽組織的產生與成熟形成了軟性骨痂，提供骨組織重建過程中一定的力學穩定性。進而成纖維組織形成纖維軟骨組織并進一步演變為透明軟骨。細胞外基質初期包含Ⅱ型膠原，但隨即在礦化前期為X型膠原替代。骨愈合過程中的軟骨組織缺乏血管網覆蓋，但在礦化過程中逐漸血管化。伴隨著Ⅰ型膠原的沉積和交織型骨組織的出現，硬骨痂形成。進而一系列的改建過程將持續數月到數年，這其中滋養血管網的改建也伴隨始終，直至達到骨組織的力學穩定狀態[5]。

總之，現階段對于骨愈合過程中炎癥血管生成的研究主要集中于骨創傷后血管紊亂狀態的糾正過程以及骨礦化過程中軟骨內血管網的形成過程。本文綜述了骨愈合過程中的炎癥反應模式，以及炎癥反應在骨愈合血管生成的作用機制。

1 骨修復過程中的炎癥反應

免疫細胞與炎性細胞因子在骨修復過程中扮演著重要角色。由于對骨細胞與免疫細胞之間的復雜調控機制認識越來越深入，骨免疫學應運而生。

1.1 破骨細胞介導的炎癥反應 在細胞來源上，破骨細胞和巨噬細胞來源于相同的祖細胞[6]。T淋巴細胞表達核因子受體活化因子配體(RANKL)刺激了破骨細胞的生成[7]。輔助性T細胞17(Th17)可以通過白介素17(IL-17)促進破骨細胞的成熟[8,9]。

隨著研究的深入，更多的炎癥信號分子被證實參與破骨細胞的調控。T細胞可以通過細胞間信號交互或者表達分泌轉化生長因子β(TGF-β)[10]、IL-4[11]以及IL-10[12]，對破骨細胞的功能進行調節。有多條信號通路參與了炎癥反應對破骨細胞的調控。Th17細胞可通過細胞因子的共同作用，激活RANKL信號通路從而啟動破骨細胞的激活，并因此阻止破骨細胞分化[13]。類似的生物效應通路主要有Th1細胞分泌的干擾素γ(IFN-γ)[13],可以啟動破骨細胞內特定酶的表達。該細胞間信號存在反饋機制，在破骨細胞酶功能變化時，可反向調節T細胞的增殖功能。

1.2 間充質干細胞與炎癥反應的調控 在骨組織損傷發生時，間充質干細胞(MSCs)被細胞因子從外周富集到損傷部位，分化為成骨祖細胞，進一步分化為成骨細胞[14,15]。MSC細胞具有一定的免疫調節功能，可下調局部的腫瘤壞死因子α(TNF-α)并上調抗炎因子IL-10[16,17]，從而影響了局部炎癥微環境。MSC細胞作為一種新的臨床細胞療法，有學者報道MSC可通過促使巨噬細胞向M2型轉化進而調節巨噬細胞的功能[18]。同時通過轉化生長因子β(TGF-β )和骨形態發生蛋白(BMP)信號通路，MSC細胞可以抑制細胞毒性T細胞的產生，并促使調節型T細胞的產生[19]。因此除了細胞因子可以刺激MSC干細胞的增殖與分化，干細胞與免疫細胞之間還存在信號反饋機制，并且通過多個信號通路調節免疫細胞的增殖、凋亡和免疫功能。

1.3 炎癥反應與成骨細胞生成 在炎癥反應過程中，T淋巴細胞與巨噬細胞釋放一系列炎癥因子對局部成骨環境產生深刻影響。在炎性細胞因子如TNF-α和IL-1的存在下，NF-кB信號通路的激活，成骨細胞在骨創傷炎癥早期生成[20],然而NF-кB信號通路的持續激活進一步可以導致MSC凋亡增加，以及成骨細胞的凋亡增多[19]。IL-4、IL-13等炎性因子則可以增強成骨細胞的細胞遷移[21]，并通過STAT信號通路調節成骨細胞內相關蛋白的表達，抑制炎癥反應發生并減少骨吸收。反之，文獻報道IL-10和IFNγ在體內體外實驗以及臨床觀察中干預間充質干細胞向成骨細胞分化[22]。

骨修復過程顯然需要穩定的免疫系統支持。文獻報道在骨愈合初期，嚴密調控下的初始免疫應答雖然短暫，但可以級聯式的引發骨修復過程[23]。然而也有研究團隊報道了免疫反應對骨愈合過程的負面影響[24]。免疫調控十分精密而復雜，TNF-α缺失會引起骨的延遲愈合，然而長時間過表達TNF-α則引起骨破壞[23]。因此相同免疫反應既可以促進骨愈合，也可以導致骨愈合障礙。

因此筆者認為骨創傷發生后，炎癥反應是一種組織損傷的保護機制，應當為后期修復和愈合的基礎。因此炎癥反應應當具有較短的周期并且可以引發進一步的愈合機制。反之，如果炎癥反應遷延或過強，會對組織造成損傷。脈管系統在這些炎癥反應中扮演重要角色，尤其是急慢性炎癥中各階段均有毛細系統參與，佐證了脈管系統對炎癥的支持作用。血管生成作用也從一個側面反應炎癥的病程。如風濕性關節炎病灶組織中，炎癥的病程常伴有血管大量生成。這種血管的過度生成往往表明骨愈合減緩。

在骨愈合初期，血流量與創傷前比較具有大幅減少。血流量在骨愈合過程中逐步提高，最終可以超過創傷發生前水平。在骨愈合過程中組織缺氧信號廣泛影響血管的生理或病理再生，其中缺氧轉錄因子(HIFs) 起到了介導血管生成的核心作用。有較多研究揭示HIF信號通路與其下游靶點血管內皮生長因子(VEGF)在骨修復和軟骨修復中起到重要調節作用[25]。在動物模型和臨床實驗中通過對該信號通路的藥物干預，發現血管生成反應與炎癥反應一樣，需要控制在合理水平以利于組織修復。

2 血管生成與炎癥反應信號轉導

盡管血管生成研究起步較早，但除血管內皮細胞外，近年來免疫細胞的作用日益受到關注。

2.1 巨噬細胞系介導的炎癥反應與血管化 巨噬細胞參與多種類型的免疫反應，是炎性血管化和血管改建的細胞樞紐。局部組織的巨噬細胞與循環血中的巨噬細胞在局部缺血模型中可刺激動脈形成因而有助于增加血管系統生成[26]。眾多分泌性產物與這一過程相關，如血管內皮生長因子(VEGF)[27]，胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)、TGFα/β、成纖維細胞生長因子(bFGF)等，白細胞介素類物質如TNF-α、IL-8、IL-1β等也有研究報道。

巨噬細胞的激活狀態可以深刻影響其對血管生成的促進作用。巨噬細胞可以激活為M1、M2巨噬細胞，通過Th1和Th2細胞提呈；M1巨噬細胞也經由經典激活信號分子如TNF-α、IFN-γ、脂多糖(LPS)等促炎因子引發早期急性炎癥。相似的，在慢性炎癥中M2型巨噬細胞通過IL-4、IL-10和IL-13等炎癥抑制因子激活，并且激活反應與血管生成或血管重塑相關[28]。而在腫瘤的血管化過程中，腫瘤巨噬細胞較M2型巨噬細胞有更明顯的極化，加速腫瘤血管化過程[29]。組織中血管的生成和重塑有顯著的關聯性，甚至有假說認為M2型巨噬細胞可以分化為一類具有特定促血管生成作用的細胞亞型[30]。

巨噬細胞在IL-4與IL-13的作用下可以分化為M2a，或在免疫復合體與TLR/IL-1R拮抗劑的作用下分化為M2b[31]。然而僅有被IL-10誘導產生的M2c型細胞具有較強的促血管生成作用，與此同時抑制炎癥反應并增加細胞外基質的沉積和重塑[32]。還有研究暗示M1、M2a以及M2c巨噬細胞在促進血管生成方面均具有重要作用并且作用各不相同[33]。M1型巨噬細胞可潛在分泌如VEGF等的血管生成因子，而M2a細胞分泌了血小板源性生長因子(PDGF)將外膜細胞募集至局部，M2c則釋放金屬蛋白酶9(MMP9)參與血管的重塑過程[33]。

2.2 非巨噬細胞參與的炎性血管生成 其他免疫細胞，如樹突狀細胞、肥大細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞等均可能在血管生成與改建的過程中參與。抗炎因子如骨化三醇或前列腺素E可以激活樹突狀細胞分泌大量VEGF以及少量成纖維細胞生長因子[34]。此外肥大細胞也可以潛在分泌VEGF、PDGF、bFGF等[35]。近年來發現，中性粒細胞在缺血組織中表達MMP-9，從而增強VEGF的血管生成效應[32]。通過在腫瘤模型領域的研究，有團隊報道了T細胞可直接參與血管再生過程，加速血管形成。出現血管損傷或缺氧的局部通過表達CCL28等可富集大量T細胞，進而提高局部VEGF水平。通過免疫耗竭方式減少局部CD25、CD4雙陽性細胞可以顯著抑制局部VEGF水平，減少血管生長速度[36]。另外學者觀察自然殺傷細胞的數量與動脈生成有關。自然殺傷細胞在血管生成過程中的作用報道較少，可能機制為釋放IFN-γ促使T細胞分化[37]。體外實驗證實VEGF可以促進T細胞的轉化，且T細胞通過與單核細胞的直接接觸和旁分泌方式導致單核細胞轉變為炎癥狀態[38]。

3 炎癥反應在血管生成與骨修復中的意義

骨愈合過程中，均需要經歷炎癥反應與血管生成過程。炎癥反應與血管生成不僅是骨愈合的關鍵過程，而且在發生過程上受到精密調控。如果炎癥反應和血管生成過程受到干擾，將導致骨愈合減緩或障礙。

3.1 血腫形成階段的調控 在骨損傷發生后，由于血管功能異常，局部形成血腫。在血腫結構中，多種細胞類型共存，這與血液中的細胞類型相一致。血腫組織暫時填充了骨創傷的缺損部位，與骨組織斷端、骨髓腔、骨膜、內皮和肌肉相接觸，這一環境給予了進一步骨修復的空間。血腫初期常見到細胞比例的快速變化，主要是由于有核細胞，尤其是中性粒細胞的壽命較短。在綿羊骨損傷模型[23]中，該觀點已經得到證實。血腫組織內的細胞組分持續發生變化，細胞毒性T細胞數量在正常愈合過程中持續下降，輔助T細胞比例上升。與此過程相伴有多重細胞因子的表達，主要是在造模后24～36 h表達抗炎性因子如IL-10和TGF-β。炎癥反應下調的同時，血管生成相關的細胞因子同期開始表達，較有代表性的是HIF-1α、血管內皮生長因子(VEGF)[23]。這一過程暗示血管生成和炎癥反應在特定階段可以具有相互依存關系。

骨膜是血管新生的重要起源，在骨損傷60 h后，骨膜中HIF-1α、PDGF、和血管內皮細胞標記物CD34等表達上調，與炎癥信號的回落相呼應。在骨修復中尤其是血管重建后與軟骨成骨發生過程中，髓細胞因子(SDF-1)在骨膜間充質干細胞與內皮細胞間均有表達，其表達水平亦與局部缺氧相關，其表達后不僅加速血管生成，且在骨膜組織中兼具有富集間充質干細胞和加快軟骨內成骨的作用[1]。SDF-1主要功能是與下游受體CXCR4結合，并激活JAK/STAT、PI3K/Akt 和ERK1/2等多條信號通路,廣泛調節效應細胞的增殖與遷移。總之骨愈合過程和血管生成通過炎癥反應引發，隨后炎癥水平的逐步下降又是血管生成反應乃至骨修復的啟動因素。

3.2 炎癥反應失調推遲血管生成 在炎癥反應失調模型中，延長了炎癥過程并觀察到血管生成發育明顯滯后。在炎癥反應延長模型中，第21天時血管假性血友病因子(vWF)在模型組骨膜中表達依然較少，而在血腫組織中血管生成相關因子包括VEGF、vWF、PDGF等均表達較少[39]。而對比正常組可以發現，正常組由于血供恢復快，因此傷后7 d可見HIF-1α表達顯著減少[23]，標志著局部供氧水平提高，血管已經再生改善局部血運。在正常組中，組織學觀察能在7 d左右見到血管形成。長期實驗觀察到血管生成速度以及骨愈合速度在炎癥反應失調動物中明顯減慢。

上述研究結果通過動物模型系統分析了炎癥反應在引發血管生成和進一步骨愈合的重要性。尤其是在傷后60 h局部愈合過程已經完全開始。然而臨床環境下骨創傷發生后需要等待較長時間接受手術，術中又往往切除血腫部分，從而損失了早期愈合過程中積累的細胞與生長因子。術后產生的新血腫和周圍組織又將處于不同的階段，從而導致骨組織愈合過程的紊亂。因此在現階段手術中如何能保存血腫組織或保存細胞環境乃是外科技術的發展方向。

4 總結與展望

骨外科領域已經廣泛認識到骨創傷后血管再通的重要性，可以增加骨愈合和重建的成功率。然而骨愈合過程中免疫系統的作用價值仍然常被忽視。國內相關研究報道尚少，有多位學者通過文獻報道形式關注了這一研究方向[40,41]。在動物研究實驗方面，張靈芝等[42]對大鼠牙槽骨組織中的炎癥反應進行了研究，并觀察到過強的炎癥反應使拔牙后損傷的牙槽骨組織高度下降，牙槽骨組織的損傷恢復減慢。免疫細胞與免疫信號與血管化之間具有直接而緊密的聯系，進一步調控骨修復中的炎癥反應將有助于骨愈合過程。過強的免疫反應或是失調的血管生成反應均將導致骨重建失敗。三大系統之間的平衡與分階段調控將成為骨修復領域的重要研究方向與治療手段。

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[收稿2016-01-13 修回2016-03-23]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.028

①本文受國家自然科學基金項目(No.81573997)、江蘇省高校自然科學研究面上項目(No.15KJD360001)和江蘇省高校研究生創新計劃項目(No.KYZZ16-0409) 資助。

袁 翰(1988年-)，男，主要從事骨組織工程和骨創傷修復方面研究，E-mail:hanyuan@njucm.edu.cn。

及指導教師：黃桂成(1958年-)，男，教授,主任醫師,博士生導師,南京中醫藥大學副校長，主要從事脊柱病和脊髓損傷與修復方面研究，E-mail:hgc@njucm.edu.cn。

R363.2

A

1000-484X(2016)12-1850-05